Triagem dos antígenos recombinantes de leishmania infantum utilizando a técnica de multi-antígenos impressos(mapia) no desenvolvimento de imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina

Abstract

As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados, quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo, os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi- Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram utilizados soros de cães com outras patologias: leishmaniose tegumentar (n = 10), tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12 obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose, tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com leishmaniose visceral canina testados. Foram identificadas duas combinações compostas por cinco antígenos, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 e Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5. Quando comparado o reconhecimento desses conjuntos com a combinação de Lci1A e Lci2B foi observado um aumento de 77% para 87%, no entanto não foi observada diferença estatística (p= 0,098) apesar desse incremento. Esse achado aponta para possibilidade de avaliar os dois conjuntos em um teste imunocromatográfico no formato do teste final (DPP). Em resumo, utilizando o teste de triagem MAPIA foi possível selecionar dois conjuntos de cinco proteínas recombinantes de L. infantum que mostraram potencial para compor um teste imunodiagnóstico no formato DPP multi-antígenos.