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IMPACTO DAS CÉLULAS TH17 NA ZIKA: ESTUDO EM DOADORAS COM HISTÓRICO DE INFECÇÃO NA GESTAÇÃO E DE CRIANÇAS EXPOSTAS AO VÍRUS DURANTE A GESTAÇÃO
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Abstract in Portuguese
Durante a gestação, bebês nascidos de mães infectadas pelo Zika vírus (ZIKV) apresentam risco maior de 42% de desenvolver anormalidades clínicas ou de neuroimagem, conhecidas como Síndrome da Zika Congênita (SZC). Sabe-se que o sistema imune de gestantes é finamente regulado, caracterizado por níveis elevados de TGF-β na circulação e placenta. Além disso, níveis elevados de citocinas relacionadas ao perfil T-helper 17 (Th17), incluindo TGF-β, IL-17, IL-1β e IL-6, foram demonstrados na infecção aguda por ZIKV. O envolvimento destas citocinas ou de células Th17 na imunopatogênese da Zika ainda não foi elucidado. Nossa hipótese é de que altos níveis circulantes de citocinas relacionadas ao perfil Th17, associados a um ambiente regulatório mediado por TGF-β na gravidez, criariam um ambiente favorável para a diferenciação de células T CD4 naive em Th17. Desta forma, o objetivo do nosso estudo é investigar se existe um potencial de diferenciação das células Th17 de memória. Essa avaliação tem como foco mulheres que foram infectadas durante a gravidez e crianças expostas ao ZIKV na gestação e que desenvolveram ou não a SZC. Assim, foram incluídas no presente estudo, mães infectadas pelo ZIKV durante a gestação (Mães, n=22) e crianças nascidas (Crianças, n=20) de mães que relataram rash cutâneo durante a gravidez durante a epidemia de ZIKV no Brasil (2015-2017). Como grupo controle, mulheres infectadas pelo ZIKV no mesmo período, mas fora do período gestacional, foram recrutadas (Mulheres, n=6). Todos os doadores foram avaliados em 2018-2019, ou seja, 10 a 45 meses anos após a infecção aguda por ZIKV. As evidências laboratoriais da infecção por ZIKV nas mulheres adultas foram confirmadas pelos resultados positivos de qRT-PCR no período agudo da infecção. Nas amostras de 2018-2019, anticorpos IgG específicos para ZIKV e DENV foram detectados por ensaio comercial de ELISA e anticorpos neutralizantes para ZIKV e DENV-1 pelo PRNT90. A caracterização das subpopulações de células Th17 foi realizada por citometria de fluxo, utilizando os marcadores CCR6, CXCR3 e CCR4. O perfil de memória dessas células foi avaliado utilizando-se os marcadores CD45RA e CCR7. A capacidade das células responderem à estimulação in vitro com peptídeos do ZIKV (ZIKV MegaPool, ZIKV MP) foi avaliada através da quantificação de citocinas detectadas no sobrenadante de cultura, relacionadas ao perfil Th17, como IL-17A, IL-6 e TGF-β por ELISA. A frequência de células T CD4+ produtoras de IL-17A+, bem como células T CD4+ IL-17A+/IFN-γ + após estimulação in vitro com ZIKV MP foi realizada por citometria de fluxo. A estimulação com ZIKV MP demonstrou uma predominância de células T CD4+ naive (Tn) em crianças. As células de memória central (Tcm) foram as mais frequentes em mulheres adultas, seguidas das células de memória efetora (Tem). A frequência de células T efetoras de memória que re-expressam CD45RA (Temra) foi inferior a 1% em todos os grupos e nenhuma diferença foi observada entre eles. Uma tendência a maior frequência de células Th1 de memória nas mães comparado às crianças e uma frequência similar de células Th2 de memória entre mães e crianças foram detectadas. Também observamos maior frequência de células Th17 nestes dois grupos. Por outro lado, no grupo de Mulheres, as células CCR6+DN foram as mais frequentes. Curiosamente, após a estimulação com ZIKV MP, houve diminuição na frequência de células de memória CCR6+ em todos os grupos. Mães e crianças tendem a produzir níveis basais elevados de IL-17A, crianças produzem mais IL-6 e mães mais TGF-β. Porém, após estimulação com ZIKV MP, foi observada redução na produção de IL17A e TGF-β no grupo de mães. A redução nos níveis de IL-17A ocorreu principalmente nas mães que tiveram filhos com SZC. A estimulação com ZIKV MP também levou a uma diminuição na frequência de células T CD4 produtoras de IL-17A (Th17) nas mães, especialmente naquelas que deram à luz bebês com SZC. Surpreendentemente, um aumento nas células T CD4 + produtoras de IL-17A+IFN-γ+ (Th1Th17) foi detectado em mães de crianças com SZC e nos dois grupos de crianças, mas não em mulheres com histórico de infecção por ZIKV fora da gravidez. Nossos dados indicam que ocorreu um priming de células T CD4 do fenótipo Th1Th17, preferencialmente em mães que deram à luz crianças com SZC e em crianças, independente do desfecho seu clínico. Com base na literatura, as células Th1Th17 são consideradas patogênicas, com tropismo para o sistema nervoso central. Ainda não está claro qual seria o papel do Th1Th17, especialmente nas mães de crianças com SZC e nas crianças. No entanto, nossos dados encorajam uma investigação mais aprofundada sobre uma possível implicação de Th1Th17 nas alterações neurológicas decorrentes da infecção pelo Zika na gestação
Abstract
Babies born to mothers infected with the Zika virus (ZIKV) during pregnancy have up to 42% higher risk of developing clinical or neuroimaging abnormalities, such as Congenital Zika Syndrome (CZS). The pregnant immune system is highly regulated, with elevated levels of TGF-β in the circulation and placenta. Elevated levels of cytokines related to the T-helper 17 (Th17) profile, including TGF-β, IL-17, IL-1β and IL-6, have been demonstrated in acute ZIKV infection. However, the involvement of these cytokines or Th17 cells in the immunopathogenesis of Zika has not yet been elucidated. Our hypothesis is that high circulating levels of cytokines related to the Th17 profile, associated with a regulatory environment mediated by TGF-β in pregnancy, would create a favorable environment for differentiation of naive CD4 T cells into Th17. Our goal is to reveal the potential for differentiation of Th17 memory cells, focusing on women who were infected during pregnancy and on children affected or not by CZS. This study included mothers infected with ZIKV during pregnancy (Mothers, n = 22) and children born (Children, n = 20) to mothers who reported skin rash during pregnancy coinciding with the ZIKV epidemic in Brazil (2015- 2017). As a control group, we recruited women infected with ZIKV without being pregnant (Women, n = 6) in the same period. These donors were obtained in 2018-2019, 10 to 45 months after acute ZIKV infection. Laboratory evidence for acute ZIKV infection was based on positive qRT-PCR results. In samples collected in 2018-2019, ZIKV- and DENVspecific IgG were detected by commercial ELISA assay and ZIKV and DENV-1 neutralizing antibodies by PRNT90. The characterization of Th17 subpopulations was performed by flow cytometry using the CCR6, CXCR3 and CCR4 markers. The memory profile of these cells was assessed using the CD45RA and CCR7 markers. The ability of cells to respond to in vitro stimulation with ZIKV peptides (ZIKV MegaPool, ZIKV MP) was assessed by quantifying cytokines related to the Th17 profile, such as IL-17A, IL-6 and TGF-β by ELISA. The frequency of CD4+ T cells producing IL-17A+, as well as CD4+ T cells IL-17A+/IFN-γ+ after in vitro stimulation with ZIKV MP was performed by flow cytometry. Stimulation with ZIKV MP alters a predominance of naive CD4+ T cells (Tn) in children. Central memory cells (Tcm) were the most frequent subpopulation in adult women, followed by effector memory cells (Tem). The frequency of memory effector T cells that re-express CD45RA (Temra) was less than 1% in all groups and no difference was observed between them. There was a trend towards a higher frequency of memory Th1 cells in mothers compared to children and a similar frequency of memory Th2 cells between mothers and children. We also observed a higher frequency of Th17 cells these two groups. On the other hand, in the Women group, CCR6+DN cells were the most frequent subpopulation. Interestingly, after stimulation with ZIKV MP, there was a decrease in the frequency of CCR6+ memory cells in all groups. Mothers and children tend to produce high baseline levels of IL-17A, children high baseline IL-6 levels and mothers more TGF-β. However, after stimulation with ZIKV MP, a reduction in the production of IL-17A and TGF-β was observed in the group of mothers. When evaluating according to the clinical outcome of their children, the reduction in IL-17A levels occurred in those who had children affected by CZS. Stimulation with ZIKV MP also led to a decrease in the frequency of IL-17A-producing CD4+ T cells (Th17) in mothers, especially in those who gave birth to children affected by CZS, with no difference in the other groups. Surprisingly, an increase in CD4+ T cells producing IL-17A+IFN-γ+ (Th1Th17) was detected in mothers who had children affected by CZS and in both groups of children, but not in women with a history of ZIKV infection. Our data indicate that a priming of CD4+ T cells of the Th1Th17 phenotype may have occurred, preferably in mothers who gave birth to children with CZS and also in children, regardless of the clinical outcome. Based on the literature, Th1Th17 cells are considered pathogenic, with tropism for the central nervous system, generating several pathological conditions. It is not yet clear what the role of Th1Th17 would be, especially in mothers of children with CZS and in children. However, our data encourage further investigation into a possible implication of Th1Th17 in the neurological changes resulting from Zika infection during pregnancy
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