Desenvolvimento e avaliação de proteínas quiméricas e recombinantes para diagnóstico sorológico da dirofilariose

Abstract

A dirofilariose é uma doença causada pelo parasito Dirofilaria immitis e transmitida por insetos vetores de diferentes gêneros. O hospedeiro definitivo é o cão, mas eventualmente o verme infecta outros mamíferos, como gatos e seres humanos. O diagnóstico dessa doença é feito por meio de testes de detecção de antígeno e de microfilárias circulante no sangue, porém estes métodos apresentam limitações. Até o momento não há um teste de captura de anticorpos disponível comercialmente que seja utilizado na rotina, mas antígenos promissores passíveis de uso nestes testes foram descritos para o diagnóstico de doenças causadas por vermes correlatos a D. immitis, como a Wb14, usado para a filariose linfática. O presente estudo buscou produzir e avaliar proteínas recombinantes, quiméricas ou não, para o diagnóstico da dirofilariose. Seis proteínas de D. immitis foram primeiramente escolhidas levando em consideração sua imunorreatividade in vitro, presença em diferentes estágios de vida do parasito, grau de identidade com espécies próximas e utilização de ortólogos no diagnóstico de outras filarioses. A partir das seis sequências foi realizada a predição de regiões com potencial ligação à linfócito B e MHC classe II, com sequências codificando epítopos promissores unidas então em um gene quimérico codificando a proteína denominada de DAW3. Esta proteína teve sua expressão avaliada em Escherichia coli e foi produzida de forma comparativa com a proteína recombinante Wb14, previamente descrita. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e utilizadas em ensaios para a avaliação de seu potencial na detecção de anticorpos em cães com dirofilariose. Foram utilizados soros de cães testados previamente para dirofilariose por teste de detecção de antígeno e/ou confirmados por teste parasitológico, sendo classificados em positivos, negativos de região endêmica e negativos de região não endêmica. Inicialmente, dois grupos de soros, um composto por misturas de soros positivos e outro por misturas de soros negativos foram testadas em ensaios Western blot onde foi possível evidenciar o reconhecimento das proteínas Wb14 e DAW3 apenas em soros positivos. Em ensaios de ELISA, a avaliação da Wb14, obtida em maior quantidade, se deu com soros positivos e negativos individuais, mostrando uma sensibilidade de 76% e especificidade de 70%. Valores de positividade foram significativamente maiores para os soros positivos (76%), mas com valores elevados ainda obtidos para soros negativos de região endêmica (48%) e soros negativos de região não endêmica (30%). Já a DAW3 só pôde ser avaliada com dois grupos de soros, um composto por misturas de soros positivos e outro por misturas de soros negativos, mas a padronização do ELISA revelou que esta proteína apresentou maior capacidade de reconhecimento de soros positivos quando comparada com a Wb14. Este é o primeiro relato de avaliação de um teste de captura de anticorpos baseado em proteínas recombinantes quiméricas em cães com dirofilariose no Brasil. Nossos dados indicam um grande potencial para proteínas quiméricas, como a DAW3 e variantes, para sua utilização em ensaios sorológicos de diagnóstico da dirofilariose. Também reforçam seu potencial para uso em estudossobre a presença de anticorpos anti-D. immitis de cães em regiões de diferentes endemicidades no Brasil (AU).