Leishmania viva atenuada pela deleção de kharon1, usando CRISPR/Cas9, para o desenvolvimento de vacinas e como modelo para estudar divisão celular.

Abstract

A busca pelo desenvolvimento de vacinas contra as leishmanioses é urgente, uma vez que não há nenhuma solução profilática segura e efetiva disponível para humanos. A utilização de parasitos vivos atenuados do gênero Leishmania como candidatos vacinais tem sido revisitada, pelo fato de hoje termos ferramentas mais precisas e eficientes de edição gênica, como o sistema CRISPR/Cas9. A deleção do gene que codifica para a proteína KHARON1 (KH1) promove defeitos no desenvolvimento que culminam com a morte de formas amastigotas intracelulares, tornando os parasitos incapazes de manterem a infecção, mostrando serem candidatos promissores para uma vacina viva atenuada. Nesse sentido, selecionamos cepas atenuadas de L. infantum e L. mexicana mediante a deleção do gene kh1 (Likh1- /- e Lmexkh1-/- ) e avaliamos o potencial vacinal contra a leishmaniose visceral em modelos de camundongos BALB/c. Os mutantes de Likh1-/- e Lmexkh1-/- foram capazes de induzir a produção de IFN-γ com diminuição de IL-10, sugerindo uma resposta imune protetora com tropismo Th1. Além disso, as vacinas foram capazes de induzir a proliferação de linfócitos T e gerar células de memória efetora e central. A eficácia da vacina foi evidenciada pela redução ou manutenção da carga parasitária no fígado e/ou no baço contra o desafio da cepa virulenta de L. infantum. Uma vez que KHARON1 está envolvida na dinâmica de divisão celular, avaliamos os níveis de expressão diferencial nos transcritos de Likh1-/- utilizando técnicas de RT-qPCR e/ou cDNA-Seq. No total, 87 alvos tiveram seus níveis de expressão alterados estatisticamente, seja upregulated ou downregulated. Ao selecionarmos alvos conhecidos associados à divisão celular e ao citoesqueleto, na ausência de kh1, as promastigotas tiveram aumento dos níveis de mRNA para Sfi1, KHAP2, TFK1, KPP1, CYC6, SETE/SETE7, PK53 e AP2, enquanto as amastigotas intracelulares apresentaram aumento da expressão de KHAP1, KHAP2 e PK53. Além disso KHAP1 e KHAP2 mostraram localizações subcelulares em pelo menos uma região em que KHARON1 está presente, mostrando possíveis interações dessas proteínas em processos fisiológicos distintos. Estas descobertas podem auxiliar na melhor compreensão de como é orquestrada a divisão celular em Leishmania, além de poderem ser estudadas como alvos farmacológicos, contribuindo no combate à leishmaniose