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DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA DE VÍRUS AMARÍLICOS RECOMBINANTES EXPRESSANDO ANTÍGENOS DA PROTEÍNA ASP-2 DE AMASTIGOTAS DE TRYPANOSOMA CRUZI
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Resumo
O vírus vivo atenuado de Febre Amarela (FA) YF 17D é uma das vacinas virais mais
seguras e eficazes já administradas a humanos, a qual induz uma resposta imune polivalente.
Estas características tornam este vírus vacinal umaplataforma tecnológica para o
desenvolvimento de novas vacinas. Através da tecnologia do clone infeccioso, nós utilizamos
o arcabouço de YF 17D para expressar epítopo indutor de linfócitos T CD8
+
, TEWETGQI e
um fragmento imunogênico, ambos provenientes da proteína de superfície de amastigota 2
(ASP-2) de Trypanosoma cruzi, parasita causador da Doença de Chagas. Este estudo
objetivou evidenciar o potencial deste vírus em expressar antígenos heterólogos. O epítopo
TEWETGQI foi clonado e expresso baseando-se em doissítios distintos do genoma: na alça
fgda proteína de Envelope (E) (YF17D/E200/Tc) e no sítio de clivagem proteolítico entre
NS2B e NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). Uma terceira estratégia envolveu a montagem de um
cassete heterólogo expressando um fragmento imunogênico de 120 aminoácidos de ASP-2
entre as proteínas E e NS1 (YF17D/ENS1/Tc). Nós investigamos se o sítio de expressão
poderia influenciar a imunogenicidade do antígeno heterólogo. Assim, foram gerados vírus
que se replicaram em cultura de células similar ao YF 17DD e permaneceram estáveis
geneticamente após algumas passagens seriadas em célula Vero. A expressão dos antígenos
heterólogos pelos vírus recombinantes revelou distintos padrões de detecção em diferentes
regiões da célula. Outros estudos de caracterizaçãomostraram que os vírus YF17D/E200/Tc e
YF17D/NS2B3/Tc são mais atenuados do que YF 17DD, quando inoculados via intracerebral
em camundongos, sendo YF17D/E200/Tc o mais atenuado. Estudos de imunogenicidade
revelaram que todos os vírus foram capazes de induzir anticorpos neutralizantes para Febre
Amarela e o vírus YF17D/ENS1/Tc induziu anticorpos que reagem especificamente com
amastigotas. Além disso, os vírus recombinantes induziram em camundongos imunizados
uma resposta celular T produtora de interferon-gama(IFN-γ) antígeno-específica, além de
uma resposta balanceada T CD4
+
e T CD8
+
para Febre Amarela. A vacinação de uma
linhagem murina altamente suscetível à infecção por T. cruzicom um regime de dose-reforço
homólogo que utilizou uma formulação de vírus YF 17D recombinantes induziu células T
CD8
+
TEWETGQI específicas após uma única dose, a qual poderia explicar o maior grau de
proteção após desafio com T. cruzi. Assim, concluímos que a plataforma de YF 17D é útil
para expressar antígenos de protozoários (T. cruzi) em regiões funcionais distintas do genoma
com um impacto mínimo na viabilidade viral. Além disso, o uso de novas formulações
contendo diferentes vírus YF 17D recombinantes parece ser uma estratégia promissora, a qual
será explorada para outros patógenos.
Resumo em Inglês
The attenuated Yellow Fever (YF) 17D vaccine virus is one of the safest and most
effective viral vaccines administered to humans, inwhich it elicits a polyvalent immune
response. These characteristics make this vaccine virus a technological platform to the
development of new vaccines. Herein, through the infectious clone technology, we used the
YF 17D backbone to express a CD8
+
T cell epitope, TEWETGQI and an immunogenic
fragment, both originated from the Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease)
Amastigote Surface Protein 2 (ASP-2). This study aimed to provide further evidence for the
potential of this virus to express foreign epitopes. The TEWETGQI epitope was cloned and
expressed in two different genomic insertion sites:the fg loop of the viral Envelope protein
(E) (YF17D/E200/Tc) and the protease cleavage site between the NS2B and NS3
(YF17D/NS2B3/Tc). A third strategy involved the construction of a heterologous cassette
expressing an immunogenic ASP-2 fragment between E and NS1 (YF17D/ENS1/Tc). We
investigated whether the site of expression had any influence on foreign antigen
immunogenicity. In this sense, we generated virus that replicated similarly to vaccine virus YF
17DD in cell culture and remained genetically stable after some serial passages in Vero cells.
The expression of the heterologous antigens by the recombinant viruses revealed distinct
patterns of detection regarding different regions of the cell. Other characterization studies
showed that YF17D/E200/Tc and YF17D/NS2B3/Tc were more attenuated than YF 17DD,
when inoculated intracerebrally in mice, YF17D/E200/Tc being the most attenuated.
Immunogenicity studies revealed that all viruses elicited neutralizing antibodies to YF virus
and YF17D/ENS1/Tc virus induced antibodies that react specifically to amastigotes.
Moreover, recombinant viruses generated an antigen specificgamma interferon (IFN-γ)
mediated T-cell response in immunized mice as well as a balanced YF T CD4
+
and T CD8
+
response. Vaccination of a mouse lineage highly susceptible to infection by T. cruziwith a
homologous prime-boost regimen of a YF 17D recombinant formulation elicited TEWETGQI
specific CD8
+
T cells after only one dose which could explain the higher degree of protection
after T. cruzichallenge. We conclude that the YF 17D platform is useful to express Protozoan
(T. cruzi) antigens at different functional regions of its genome with minimal reduction in
vector viability. Besides, the use of new viral formulations composed of different YF 17D
recombinant viruses seem to be a promising strategythat will be explored to other pathogens.
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