Estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na liberação de armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) em resposta a infecção in vitro por Toxoplasma gondii e seu papel no controle da carga parasitária

Abstract

Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório presente no mundo todo, infectando de forma crônica cerca de um terço da população. A ação do sistema imune contra o parasito é essencial para impedir sua disseminação no organismo e evitar graves consequências. As armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) formam um mecanismo de defesa mediada por neutrófilos que consiste no descondensamento da cromatina que, associada a histonas e peptídeos antimicrobianos, é liberada para o meio extracelular, aprisionando e matando patógenos. Atualmente se sabe que existe duas formas distintas de liberação de NET: rápida/vital e clássica/tardia. A NET rápida é liberada após poucos minutos de indução e mantêm a viabilidade do neutrófilo, permitindo a realização de outras funções, enquanto a NET clássica ocorre após algumas horas de indução, levando ao rompimento da membrana celular e consequente a morte do neutrófilo. Esse mecanismo foi demonstrado por neutrófilos de diversos hospedeiros intermediários e definitivo do T. gondii, porém o papel das NETs produzidas por neutrófilos humanos em resposta ao parasito e os mecanismos envolvidos no processo ainda necessitam de mais esclarecimento. Sendo assim, nosso objetivo com este trabalho foi caracterizar a produção de NET por neutrófilos humanos em resposta ao T. gondii e seu impacto no controle da carga parasitária. Neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis foram incubados com taquizoítos da cepa RH (MOI 5:1) por 15 e 180 minutos, representando NET rápida e clássica, respectivamente. Após infecção, sobrenadantes foram coletados e DNA foi quantificado por PicoGreen. Em paralelo, células foram fixadas e processadas para microscopia de imunofluorescência e eletrônica de varredura (MEV). Ensaios de viabilidade e infectividade do parasito foram realizados após interação entre célula e parasito. Nossos resultados mostram que taquizoítos induzem a liberação de NET rápida e clássica por neutrófilos humanos, sendo essas compostas por DNA, histona H1 e mieloperoxidase, com a presença de vacúolos autofágicos, evidenciadas por microscopia de imunofluorescência. A interação analisada por MEV apontou dois fenótipos distintos das NETs nos tempos avaliados, ambos eficientes na associação com o parasito. Através de ensaio com inibidores farmacológicos confirmamos a participação de PAD4 e elastase neutrofílica para liberação de NET clássica e cálcio, ROS, PI3Kγ e PI3Kδ para NET rápida, sugerindo possível participação de autofagia. Por fim, demonstramos que apesar de aparentar aprisionar os parasitos, as NETs não afetam viabilidade e infectividade do mesmo. Em conjunto, estes dados contribuem com a compreensão de um mecanismo importante da imunidade inata no enfrentamento ao T. gondii