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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/56012
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PADRONIZAÇÃO DOS CORTES HISTOLÓGICOS DE BAÇO A SEREM USADOS COMO FONTE DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA MALÁRIA HUMANA.
Souza, Raimunda Sandra Pacheco | Data do documento:
2022
Autor(es)
Orientador
Coorientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Leônidas e Maria Deane. Manaus, AM, Brasil.
Resumo
A malária continua sendo um problema de saúde pública e dentre as formas graves da doença encontra-se a malária esplênica ocasionada, principalmente, pelo Plasmodium vivax. O diagnóstico padrão ouro é a gota espessa, porém apresenta limitações como necessidade de microscopistas treinados, leitura difícil e cansativa, etc., dificultando o controle efetivo da malária. O objetivo do estudo foi padronizar cortes histológicos de baço a serem usados como fonte de material biológico para o diagnóstico molecular da malária humana. Foi selecionado uma amostra de baço incluída em parafina sabidamente positiva para P.vivax, foi realizado a microtomia com diferentes quantidades e
espessuras, sendo seis, oito, dez, quinze, vinte e vinte e cinco cortes histológico com espessura 10 µm e outros cinco e dez cortes com espessura de 20 µm. Foi realizado a desparafinização com xilol e etanol e álcool 70% ,foi testado uma lavagem com xilol uma com etanol absoluto e uma com álcool a 70%. Uma lavagem de xilol e uma de etanol retirando o álcool 70% e posterior duas lavagens de xilol e etanol, após a desparafinização os tecidos foram secos em temperatura ambiente e pesados em balança analítica. A extração de DNA foi feita com kits comerciais sendo um especifico para sangue (DNA Blood Minikit) e o outro para tecido (QIAamp FAST DNA Tissue kit) . Foi realizada a qPCR
para Plasmodium sp. com alvo no gene 18S e P. vivax em regiões conservadas do gene PvmtCOX1. Então, foram selecionadas amostras do anode 2021de um laboratório referência para exame histopatológico em Manaus, Amazonas para serem analisadas como teste, as amostras foram testadas para gênero especifico,e espécie especifico de Plasmodium sp. e também para DNA humano. Padronizou-se cortes histológicos, bem como a desparafinização e método de extração de DNA. A amostra com dez cortes e espessura de 20 µm desparafinada com duas lavagens de xilol e duas de etanol absoluto com peso de 40 mg, com o DNA extraído a partir de ambos os kits, com concentração
de DNA de 50ng/µL para kit de sangue e55ng/µL para kit de tecido apresentou-se positiva na qPCR para gênero e espécie especifico. E a amostras analisadas como teste apresentaram-se negativa na
qPCR para gênero e espécie espécifico e positiva para DNA humano.
Resumo em Inglês
Malaria continues to be a public health problem and among the severe forms of the disease is splenic malaria caused mainly by Plasmodium vivax. The gold standard diagnosis is thick sputum, but it has limitations such as the need for trained microscopists, difficult and tiring reading, etc., making it difficult to effectively control malaria. The objective of the study was to standardize histological sections of the spleen to be used as a source of biological material for the molecular diagnosis of human malaria. A spleen sample embedded in paraffin known to be positive for P.vivax was selected, microtomy was performed with different amounts and thicknesses, with six, eight, ten, fifteen, twenty
and twenty-five histological sections with a thickness of 10 µm and another five and ten slices with a thickness of 20 µm. Deparaffinization was performed with xylol and ethanol and 70% alcohol, a wash with xylol, one with absolute ethanol and one with 70% alcohol was tested. One xylol wash and one ethanol wash, removing the 70% alcohol and two xylol and ethanol washes. After deparaffinization, the tissues were dried at room temperature and weighed on an analytical balance. DNA extraction was performed with commercial kits, one specific for blood (DNA Blood Minikit) and the other for tissue (QIAamp FAST DNA Tissue kit). qPCR was performed for Plasmodium sp. targeting the 18S gene and P. vivax in conserved regions of the PvmtCOX1 gene. Then, samples from the year 2021 were selected from a reference laboratory for histopathological examination in Manaus, Amazonas to be analyzed as a test, the samples were tested for specific genus, and specific species of Plasmodium sp. and also for human DNA. Histological sections were standardized, as well as the deparaffinization and DNA extraction method. The sample with ten sections and 20 µm thickness, dewaxed with two washes of xylol and two washes of absolute ethanol weighing 40 mg, with DNA extracted from both kits, with a DNA concentration of 50ng/µL for a blood kit e55ng/µL for tissue kit was positive in qPCR for specific genus and species. And the samples analyzed as a test were negative in qPCR for specific genus and species and positive for human DNA.
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