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AVALIAÇÃO DE ASSINATURAS GÊNICAS EM PACIENTES COM FEBRE AMARELA PARA IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES DE PROGNÓSTICO
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Abstract in Portuguese
A febre amarela é uma doença hemorrágica, causada por um arbovírus do gênero Flavivirus, acometendo cerca de 200 mil pessoas anualmente em mais de 40 países, incluindo o Brasil. Entre 2016 e 2018 houve importantes surtos da doença, acometendo mais de duas mil pessoas, principalmente na região sudeste do país. Também foi relatado que alguns pacientes apresentaram quadro de hepatite de recidiva tardia após melhora clínica e laboratorial, entre 40 e 70 dias após os sintomas iniciais, com presença do vírus confirmada em fragmento de biópsia hepática. Diante disso, o presente estudo buscou avaliar um painel de 44 genes envolvidos em vias de sinalização, no processo de ativação da coagulação, no reconhecimento de produtos imunogênicos, em eventos hemorrágicos e nas funções de imunidade inata, inflamassoma e apoptose, em pacientes curados e pacientes que apresentaram hepatite de recidiva tardia, a fim de se correlacionar os perfis de expressão desses genes com o prognóstico da doença. Primeiramente, foram realizadas padronizações de extrações de RNA, definindo protocolos que priorizam maiores rendimentos de RNA na extração. Assim, as amostras processadas por Cell strainer apresentaram maior rendimento pelo método do TRIzol™ Reagent e para as amostras armazenadas como fragmentos de coágulo ficou estabelecida a utilização apenas do TRIzol™ Reagent em contato com a superfície dos fragmentos. Para a síntese de cDNA, o melhor desempenho foi do Kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription; e para as extrações de DNA, o kit QIAamp® DNA Blood Mini. Foram obtidas e utilizadas em extrações de RNA e/ou DNA, 124 amostras de pacientes do surto de 2017-2018, divididas em: pacientes que apresentaram febre amarela e foram efetivamente curados, amostras coletadas no período de 07 a 15 dias (FA 07-15d), 16 a 35 dias (FA 16-35d), e 61 a 90 dias após início dos sintomas (FA 61-90d); e pacientes que apresentaram hepatite de recidiva tardia, amostras coletadas no período de 07 a 15 dias (Hep 07-15d), 16 a 35 dias (Hep 16-35d) e 61 a 90 dias após início dos sintomas (Hep 61-90d). Foram realizados ensaios TaqMan® Array Cards com RNAs de 80 amostras. Foram utilizados como genes de referência os transcritos de GAPDH e ACTB por serem expressos de forma mais estável nas amostras analisadas. As análises estatísticas foram realizadas com os valores de 2-ΔCrt. Os marcadores CASP3, CASP8, CXCR1, IL18, MAPK3, FAS e FCGRT foram diferencialmente expressos entre os indivíduos que apresentaram febre amarela e foram efetivamente curados, nos períodos 07-15d e 16-35d, quando comparado com indivíduos que apresentaram hepatite de recidiva tardia, nos mesmos períodos. A análise de assinaturas ascendentes de biomarcadores mostrou que IL18, TNFRSF1A, CXCL2, CASP3, e IL6, envolvida em reparo de danos hepáticos, são mais frequentes no grupo FA 16-35d, enquanto IL27 é mais frequente no grupo Hep 07-15d, indicando que esses genes podem ser possíveis biomarcadores de prognóstico para a hepatite de recidiva tardia. A via de resposta imunológica do papel da PKR na resposta celular antiviral induzida por estresse é a mais representativa que engloba os genes selecionados para o estudo (CASP3, CASP8, IFNA2, IFNB1, IFNG, IL6, IL10, MAPK1, MAPK3, NFKB1, TLR3 e TNFRSF1A).
Abstract
Yellow fever is a hemorrhagic disease, caused by arboviruses of the genus Flavivirus, affecting about 200,000 people per year in more than 40 countries, including Brazil. There were two disease outbreaks between 2016 and 2018, with more than 2,000 human cases, affecting mainly the southeastern region of Brazil. It was also reported that some patients presented late-relapsing hepatitis after clinical and laboratorial biomarkers improvement, after 40 and 70 days from the initial symptoms, with the presence of the virus confirmed in a liver biopsy fragment. Therefore, the present study searches to evaluate a panel of 44 genes involved in signaling pathways, coagulation activation process, recognition of immunogenic products, hemorrhagic events, and the functions of innate immunity, inflammasomes, and apoptosis, in patients cured and with late-relapsing hepatitis, to correlate the expression profiles of these genes with the disease prognosis. First, standardization of RNA extractions was performed, defining protocols prioritizing higher quantities of RNA in extraction. Thus, samples processed by Cell strainer showed higher quantities by the TRIzol™ Reagent method and for samples stored as clot fragments, it was established the use of the TRIzol™ Reagent supernatant, which was in contact with the clot fragments surface. For cDNA synthesis, the best performance was the High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; and for DNA extractions, the QIAamp® DNA Blood Mini Kit. 124 samples from patients from the 2017-2018 outbreak were obtained and used in RNA and/or DNA extractions, divided into: patients who had yellow fever and effectively cured, samples collected in 07 to 15 days (FA 07 -15d), 16 to 35 days (FA 16-35d) and 61 to 90 days after symptom onset (FA 61-90d); and patients with late-relapsing hepatitis, samples collected in 07 to 15 days (Hep 07-15d), 16 to 35 days (Hep 16-35d) and 61 to 90 days after symptom onset (Hep 61-90d). Assays with customized TaqMan® Array Cards containing 44 genes were performed with RNAs from 80 samples. GAPDH and ACTB transcripts were used as reference genes, as they were more stably expressed in the samples analyzed. Statistical analyzes were performed with 2-ΔCrt values. The CASP3, CXCL1, CXCR1, IL6, MAPK3, FAS, ELANE, and FCGRT markers were differentially expressed among individuals who had yellow fever and were effectively cured, in the periods 07-15d and 16-35d, when compared to individuals who had late-relapsing hepatitis, in the same periods. The analysis of ascendant biomarker signatures showed that IL18, TNFRSF1A, CXCL2, CASP3, and IL6, involved in liver damage repair, are more frequent in the FA 16-35d group, while IL27 is more frequent in the Hep 07-15d group, indicating that these genes may be possible prognostic biomarkers. The pathway of the role of PKR in stress-induced antiviral cell response is the most representative metabolic pathway of the genes selected for the study (CASP3, CASP8, IFNA2, IFNB1, IFNG, IL6, IL10, MAPK1, MAPK3, NFKB1, TLR3, and TNFRSF1A).
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