Plataforma sorológica pela citometria de fluxo para detecção de anticorpos contra antígenos sanguíneos de Plasmodium vivax

Abstract

A malária causada pelo P. vivax atinge milhões de pessoas no mundo sendo responsável por grande parte da morbidade da malária humana. Considerando que as medidas de controle atualmente disponíveis apresentam limitações, faz-se necessário intensificar esforços para o desenvolvimento de metodologias alternativas que possam efetivamente contribuir para o controle e eliminação da doença em longo-prazo. Para isso, torna-se necessário avaliar a resposta imune contra os principais antígenos candidatos à vacina, e marcadores de exposição, considerando o novo perfil epidemiológico de transmissão reduzida da malária no Brasil e no mundo. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi de desenvolver plataformas sorológicas pela citometria de fluxo para avaliar anticorpos contra as formas sanguíneas do P. vivax que possam ser indicativos de imunidade adquirida (Parte I) ou de infeção aguda ou recente (Parte II). Para identificar anticorpos relacionados a imunidade adquirida, o presente trabalho concentrou-se na resposta de anticorpos que bloqueiam a principal via utilizada pelo P. vivax na invasão dos reticulócitos, mediada pela região II da Duffy binding protein (DBPII) e seu receptor DARC presente na superfície dos eritrócitos. Apesar dos anticorpos capazes de bloquear a interação DBPII-DARC (binding inhibitory antibodies, BIAbs) estarem associados a proteção clínica, poucos estudos têm investigado estes anticorpos funcionais. Parte da dificuldade se deve a complexidade dos ensaios funcionais que avaliam a interação DBPII-DARC. Baseado na hipótese de que uma resposta de anticorpos anti-DBPII contra diferentes variantes alélicas da proteína poderia ser indicativa de BIAbs, padronizou-se um ensaio multiplex para a detecção da resposta de anticorpos contra diferentes construções de DBPII, incluindo epítopos conservados (DEKnull-2) e polimórficos de variantes nativas prevalentes na Amazônia (Sal-1 e Brz-1). O desenho do estudo incluiu 245 amostras plasmáticas de indivíduos com histórico de longa exposição á malária na Amazônia. As amostras foram caracterizadas pela presença de BIAbs através do ensaio funcional de referência que utiliza células COS-7 expressando a DBPII (padrão-ouro). Os resultados mostraram que a plataforma de citometria aqui desenvolvida permitiu, com elevada acurácia, identificar indivíduos com anticorpos BIAbs. De relevância, o ensaio poderá ser adaptado para outras áreas endêmicas, sendo necessário a inclusão de variantes alélicas prevalentes na área a ser estudada. Em uma segunda parte do projeto, buscou-se identificar anticorpos associados a presença de infecção aguda ou recente por P. vivax. A hipótese do trabalho foi a de que a resposta de anticorpos contra antígenos sanguíneos altamente imunogênicos seria indicativa de infecção aguda, e/ou exposição recente ao P. vivax, particularmente, para indivíduos sem história de exposição prévia à malária. Para tal, padronizou-se um ensaio sorológico pela citometria de fluxo para determinar a resposta de anticorpos contra uma proteína quimérica composta pelos antígenos AMA-1 e MSP1-19 (AMA1/MSP1-19). A população de estudo foi constituída de indivíduos primoinfectados pelo P. vivax, residentes em Minas Gerais (área não endêmica) ou na Amazônia (RO e AM). Em conjunto, os resultados da resposta de anticorpos IgM e IgG mostraram que a proteína quimérica foi altamente imunogênica nas populações de estudo (frequência de resposta variando de 57-76% para IgM e 78% para IgG). No ensaio de multiplex, a acurácia da proteína quimérica foi superior as proteínas individuais, com especificidade de 90-95% e sensibilidade 60-64%. De interesse, nas amostras dos indivíduos residentes fora da área de transmissão, ensaios de cinética demonstram que anticorpos IgG (mas não IgM) permitiram identificar um “booster” na resposta em indivíduos que apresentaram episódios de recaídas. Em resumo, os resultados demonstram o potencial da plataforma multiplex na avaliação da resposta de anticorpos em primoinfecção pelo P. vivax. Ensaios futuros fazem-se necessários para aumentar a sensibilidade do ensaio visando o potencial uso em bancos de sangue localizado fora da área endêmica e/ou para identificar indivíduos com infecção aguda ou recente em surtos de transmissão por P. vivax.