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AVALIAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE SCHISTOSOMA MANSONI COMO ANTÍGENO EM UM NOVO TESTE DE IMUNODIAGNÓSTICO DA ESQUISTOSSOMOSE
Oliveira, Gabriela de | Fecha del documento:
2020
Autor
Director
Co-director
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Resumen en portugues
Apesar dos avanços alcançados nas últimas décadas pelas ações de controle da esquistossomose, a doença ainda permanece como um grave problema de saúde pública mundial. Ainda são necessárias novas intervenções para alcançar a sua eliminação, ou até mesmo o controle da transmissão da doença. Um dos obstáculos para se alcançar a meta de eliminação da doença é a sensibilidade do método de diagnóstico utilizado. Atualmente, o diagnóstico parasitológico pela técnica de Kato-Katz é o recomendado pela OMS. Entretanto, este método apresenta uma baixa sensibilidade na detecção da infecção pelo S. mansoni, principalmente em áreas de baixa endemicidade e baixa intensidade de infecção. Portanto, faz-se necessário o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico, tais como os testes sorológicos, que sejam mais sensíveis e capazes de detectar precisamente as infecções ativas. Nesse contexto, foi selecionada, em um trabalho prévio de imunoproteômica realizado pelo nosso grupo, uma proteína de S. mansoni, denominada neste trabalho de PPE, que foi reconhecida exclusivamente pelo soro de indivíduos infectados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial da proteína PPE de S. mansoni para compor um novo teste de imunodiagnóstico da esquistossomose quando utilizada em sua forma recombinante. Para isso, a proteína PPE foi expressa em sistema procarioto, em fusão com uma cauda 6xHIS, e purificada a partir da fração solúvel do extrato bacteriano por afinidade com íons de níquel. A proteína recombinante foi obtida com rendimento e níveis de pureza satisfatórios, e se manteve estável por no mínimo sete dias a 4oC e a temperatura ambiente. Além disso, a PPE recombinante manteve o mesmo perfil de reconhecimento antigênico observado anteriormente para a proteína nativa. Em seguida, foi avaliada a reatividade de IgG e IgG4 presentes no soro de indivíduos infectados e não infectados pelo S. mansoni contra a proteína PPE recombinante em ensaios de ELISA e a reatividade de IgG, IgG4 e IgA em ensaios de citometria de fluxo. Nos ensaios de ELISA, a reatividade de IgG foi avaliada utilizando as amostras de soro diluídas 1:40, 1:80 e 1:100. Nestas três diluições foi possível discriminar os indivíduos infectados dos indivíduos não infectados, tanto de área endêmica quanto de área não endêmica para esquistossomose. O teste utilizando as amostras de soro diluídas 1:100 apresentou o melhor desempenho, sendo obtidos os valores de sensibilidade de 88,89%, especificidade de 74,36% e acurácia global AUC = 0,86. Já nos testes de ELISA para análise da reatividade de IgG4 foi possível discriminar os indivíduos infectados apenas dos indivíduos saudáveis de área não endêmica. Nestes testes as amostras de soro foram diluídas 1:80 e 1:100, e apresentaram um desempenho semelhante entre eles, com valores de sensibilidade de 76,47% e 70,59%, especificidade de 79,49% e 82,05%, e acurácia global 0,75 e 0,70, respectivamente. Após confirmar o acoplamento da PPE recombinante às microesferas funcionais, foi avaliada a reatividade das imunoglobulinas IgG, IgG4 e IgA em ensaios de citometria de fluxo. Nos testes realizados com IgG e IgG4 foi possível diferenciar os indivíduos infectados dos indivíduos não infectados, de área endêmica e de área não endêmica para esquistossomose. Entretanto, o teste com IgA não foi capaz de discriminar entre os indivíduos infectados e não infectados de área endêmica. Dentre os três testes realizados, o que avaliou a reatividade de IgG4 contra a PPE apresentou melhor desempenho, com valores de sensibilidade de 90,91%, especificidade de 80% e acurácia global AUC = 0,90. Os resultados obtidos neste trabalho demostraram que a proteína PPE recombinante é um antígeno promissor para ser utilizado no diagnóstico sorológico da esquistossomose e que os testes desenvolvidos têm potencial para serem utilizados no diagnóstico acurado da doença.
Resumen en ingles
Despite the advances in schistosomiasis control over the last decade, the disease remains a serious public health problem worldwide. New interventions are still needed to achieve disease elimination, or even to control its transmission. One of the obstacles is the sensitivity of the diagnostic method used. Currently, the parasitological diagnosis using the Kato-Katz method is recommended by the WHO. However, this method presents low sensitivity in the detection of S. mansoni infection when used in areas of low endemicity and low intensity of infection. Therefore, it is necessary to develop new diagnostic tests, such as serological tests, capable of detecting active infections with higher sensitivity. In this context, in a previous immunoproteomics study carried out by our group, a S. mansoni protein, named in this study as PPE, was selected due to its recognition exclusively by the serum of infected individuals. Thus, the purpose of this study was to evaluate the potential of the recombinant S. mansoni PPE protein as an antigen to compose a new immunodiagnostic test for schistosomiasis. For this, the PPE protein was expressed in prokaryotic system, fused to a 6xHIS tag, and purified from the soluble fraction of the bacterial extract by its affinity to nickel ions. The recombinant protein was obtained with satisfactory yield and purity levels and remained stable for at least seven days at 4oC and at room temperature. In addition, the recombinant PPE showed the same antigen recognition profile previously observed for the native protein. Then, the reactivity of IgG and IgG4 against the recombinant PPE protein was evaluated in ELISA, and the reactivity of IgG, IgG4 and IgA, in flow cytometry assays using sera from individuals infected and not infected by S. mansoni. In ELISA assays, the reactivity of IgG was evaluated at the serum dilutions 1:40, 1:80 and 1: 100. In these three dilutions, it was possible to discriminate infected individuals from non-infected individuals, from both endemic and non-endemic areas for schistosomiasis. The assay performed at 1:100 serum dilution showed the best performance, with 88.89% sensitivity, 74.36% specificity and global accuracy AUC = 0.86. IgG4 reactivity against recombinant PPE could also discriminate infected individuals from healthy individuals from non-endemic areas but could not differentiate infected individuals from the non-infected one living in endemic areas for schistosomiasis. In these assays, serum samples were diluted 1:80 and 1: 100, and showed similar performance between them, with 76.47% and 70.59% sensitivity, 79.49% and 82.05% specificity, and overall accuracy of 0.75 and 0.70, respectively. After validating the conjugation of the recombinant PPE to the functional beads, the reactivity of the immunoglobulins IgG, IgG4 and IgA against the recombinant protein was evaluated in the flow cytometry assays. When anti-IgG or anti-IgG4 detection antibodies were used in the tests, it was possible to differentiate infected individuals from non-infected individuals, from both endemic and non-endemic areas for schistosomiasis. However, the test using anti-IgA detection antibody was not able to discriminate between infected and non-infected individuals from endemic area. Among the three tests, the one that evaluated the IgG4 reactivity against recombinant PPE showed better performance, with 90.91% sensitivity, 80% specificity and overall accuracy of 0.90. The results obtained in this study showed that the recombinant PPE is a promising antigen to be used in a serological diagnosis test for schistosomiasis and that the tests developed have the potential to be applied to accurately diagnose the disease.
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