Obtenção de clones infecciosos de ZIKV para estudos de atenuação viral

Abstract

O vírus Zika (ZIKV) é um importante patógeno humano, associado a complicações graves como a síndrome congênita do ZIKV em neonatos, e a síndrome de Guillain-Barré em adultos. Até o momento, não estão disponíveis vacinas ou drogas antivirais contra a infecção por ZIKV, tornando-se um importante desafio o seu desenvolvimento. Esse trabalho teve como objetivo a construção de variantes de ZIKV atenuadas, obtidas pela tecnologia de genética reversa envolvendo plasmídeos bacterianos. Conhecidamente, o cDNA de ZIKV é instável em Escherichia coli, assim, foi estabelecida uma metodologia de construção de ZIKV sintético, baseado no vírus epidêmico Rio-U1, através clonagem do cDNA de ZIKV em um sistema de dois plasmídeos, utilizando o pCC1, um plasmídeo de cópia única. Para mitigar as restrições de rendimento de massa de cDNA, acoplou-se reações de PCR em diferentes etapas do protocolo, favorecendo a montagem do molde completo de cDNA de ZIKV, possibilitando a recuperação viral após transcrição in vitro. O clone IC.ZIKV-Rio-U1 demonstrou padrões de proliferação viral em modelos celulares muito similares ao vírus parental. Além disso, se mostrou virulento em camundongos AG129, exibindo os mesmos sinais de acometimento neurológico desenvolvidos pelo vírus parental. A partir da obtenção de IC.ZIKV-Rio-U1, foram desenvolvidas duas abordagens para promoção de atenuação viral, ambas envolvendo os genes NS4B e NS5. A primeira, foi baseada no fato de que, ao comparar ZIKV circulantes nas Américas com a linhagem ancestral Malásia de 1966, foi observado que a maioria das mutações sinônimas e não sinônimas ocorreu nas proteínas NS4B e NS5. Para avaliar se essas mutações influenciaram na virulência de ZIKV, foi construído o vírus quimérico IC.ZIKV-ns4b-ns5/Mal, a partir da substituição dos genes NS4B e NS5 de ZIKV Rio-U1 pelos genes equivalentes, derivados da linhagem ancestral. Não houve diferença significativa na virulência dos vírus IC.ZIKV-ns4b-ns5/Mal e IC.ZIKV-Rio-U1 em diferentes modelos celulares, mas foi observada uma ligeira diminuição na virulência em modelo de camundongos AG129. A segunda abordagem consistiu na desotimização de pares de códons dos genes NS4B e NS5, através de permuta nucleotídica baseada em dois algoritmos distintos, dN231 e N3, criando os vírus IC.ZIKV-ns4b-ns5/dN231 e IC.ZIKV-ns4b-ns5/N3, respectivamente. Estudos de infecção celular e em camundongos AG129 demonstraram que apenas IC.ZIKV-ns4b-ns5/N3 exibiu perfil menos proliferativo em modelos celulares e menos virulento em camundongos AG129, demonstrando um padrão atenuado em comparação ao vírus IC.ZIKV-Rio-U1. Além disso, o vírus IC.ZIKV-ns4b-ns5/N3 induziu imunidade em camundongos AG129, protegendo esses animais contra desafio letal com o vírus selvagem Rio-U1. Esses resultados demonstram que, a estratégia de desotimização de pares de códons pode ser uma ferramenta para o desenvolvimento de vírus atenuados e protótipos vacinais