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2023-03-16
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PAPEL BIOLÓGICO DA TRIPANOTIONA REDUTASE NA VIRULÊNCIA DE LEISHMANIA INFANTUM
Fonseca, Myslene Soares da | Fecha del documento:
2021
Director
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumen en portugues
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitos protozoários do gênero Leishmania. Parte do ciclo biológico da Leishmania ocorre no interior dos vacúolos parasitóforos das células mononucleadas de defesa do sistema imunológico do hospedeiro vertebrado. No interior desses vacúolos, os parasitos sobrevivem ao estresse oxidativo devido a um eficiente sistema de controle do balanço redox baseado principalmente na função da tripanotiona redutase (TR). Além do papel da TR no controle do balanço redox, estudos anteriores já demonstraram a importância desta enzima em processos relacionados a viabilidade celular e virulência em tripanossomatídeos. Porém, o papel da TR na virulência de espécies do Novo Mundo ainda não foi estudado. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi investigar o papel da TR de L. infantum na virulência, comparando a atividade desta enzima com uma espécie de Leishmania não virulenta ao mamífero, L. tarentolae. Inicialmente, avaliamos a atividade da TR, através do método de Ellman, em parasitos patogênicos e não patogênicos a mamíferos, L. infantum e L. tarentolae, respectivamente. Nossos resultados revelaram que a atividade enzimática da TR de L. infantum foi superior a de L. tarentolae. Também, observamos diferenças nas sequências nucleotídicas e de aminoácidos da TR de L. infantum e L. tarentolae. Adicionalmente, construímos um modelo tridimensional da TR de L. tarentolae por modelagem comparativa. Este modelo foi comparado com a estrutura cristalizada da TR de L. infantum, onde observou-se que as estruturas são altamente conservadas e possuem diferenças na superfície eletrostática, principalmente no sítio catalítico. Além disso, também foram observadas diferenças nas interações intermoleculares entre a tripanotiona redutase e a tripanotiona reduzida tanto de L. infantum quanto de L. tarentolae. Para avaliar o papel da TR na infectividade de L. infantum, realizamos a superexpressão dessa enzima através da transfecção dos parasitos de L. infantum com o vetor recombinante construído (pSP72αNEOα + TR de L. infantum). A superexpressão foi caracterizada através do método de Ellman, onde foi constatado um aumento significativo da atividade da TR das promastigotas de L. infantum que superexpressam a TR em relação às promastigotas selvagens. Em seguida, analisamos a infectividade da cepa de L. infantum mutante e verificamos que os parasitos de L. infantum que superexpressam a TR tiveram um aumento significativo no índice de infecção em macrófagos murinos nos tempos de 24 e 48 horas quando comparados aos parasitos selvagens. A população de promastigotas metacíclicas e a atividade da TR dos parasitos metacíclicos da cepa mutante foi avaliada. Os parasitos de L. infantum que superexpressam a TR obtiveram um aumento da população de promastigotas metacíclicas em relação aos parasitos selvagens. Ademais, os parasitos metacíclicos que superexpressam a TR mantiveram o aumento da atividade enzimática. Também expressamos a TR de L. infantum em L. tarentolae, onde constatou-se que os parasitos de L. tarentolae que expressam a TR de L. infantum tiveram um aumento significativo da atividade da TR. Por fim, a infectividade desses parasitos foi analisada e verificou-se um aumento no índice de infecção em macrófagos murinos em 24 horas em relação aos parasitos selvagens. Estes dados revelam que a enzima tripanotiona redutase, além de controlar o balanço redox em tripanossomatídeos, também pode ter um papel relevante na infectividade de Leishmania
Resumen en ingles
Leishmaniasis are neglected tropical diseases caused by protozoan parasites of the Leishmania genus. Part of the Leishmania's biological cycle occurs inside the parasitophorous vacuoles of the mononucleated cells of the vertebrate host's immune system. Inside these vacuoles, the parasites survive the oxidative stress due to an efficient redox balance control system, based mainly on the trypanothione reductase (TR) function. In addition to the role of TR in controlling the redox balance, previous studies have demonstrated the significance of this enzyme in processes related to cell viability and virulence in trypanosomatids. However, the role of TR in the virulence of New World Leishmania species have not yet been studied. In this context, the aim of this work was to investigate the role of L. infantum TR in virulence, comparing the activity of this enzyme with a species of mammal non-virulent Leishmania, L. tarentolae. We evaluated the activity of TR through Ellman’s method in mammal’s pathogenic and non-pathogenic parasites, L. infantum and L. tarentolae, respectively. Our results demonstrated that the TR activity observed in L. infantum was higher than observed in L. tarentolae. Furthermore, we observed differences in the nucleotide and amino acid sequences of the TR of L. infantum and L. tarentolae. Additionally, a three-dimensional model of the L. tarentolae TR has been constructed using comparative modeling. The L. tarentolae TR model was compared with a 3D structure of the L. infantum TR, where it was observed that the structures are highly conserved. However, differences in the electrostatic surface, mainly in the catalytic site were observed. In addition, differences in intermolecular interactions between trypanothione reductase and reduced trypanothione of both L. infantum and L. tarentolae were observed. In order to assess the role of TR in the infectivity of L. infantum, we overexpressed this enzyme by transfecting the parasites of L. infantum with the recombinant vector (pSP72αNEOα + TR of L. infantum). The overexpression was confirmed using the Ellman’s method, where it was verified a significant increase in the TR activity of L. infantum parasites that overexpress the TR in relation to wild-type parasites. Next, we analyzed the infectivity of L. infantum mutant strain, demonstrating that these parasites had a significative increase in the infection index in murine macrophages by 24 and 48 hours when compared with wild-type parasite strains. The metacyclic promastigote population and the TR activity of metacyclic parasites were evaluated. The L. infantum parasites that overexpress the TR obtained an increase in the population of metacyclic promastigotes in comparison to wild-type parasite strains. Additionally, metacyclic parasites that overexpress TR maintained an increase in enzyme activity. We also expressed the TR of L. infantum in L. tarentolae, where it was noted that L. tarentolae parasites express the L. infantum TR, having a significant increase in TR activity. Lastly, the infectivity of these parasites was analyzed and there was an increase in the infection index in murine macrophages by 24 hours in comparison to wild-type parasite strains. These data reveal that the trypanothione reductase enzyme, that is responsible to the redox balance in trypanosomatids, may also be important in Leishmania infectivity
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