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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/53293
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DissertaçãoDireito Autoral
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CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES DE GENES DO MYCOBACTERIUM LEPRAE
Corrêa, Meydson Benjamim Carvalho | Data do documento:
2022
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
Apesar dos primeiros estudos envolvendo o agente etiológico Mycobacterium leprae revelarem uma baixa diversidade genética, trabalhos mais recentes utilizando sequenciamento completo de nova geração (WGS) revelaram uma diversidade genética maior do que reportada anteriormente, inclusive entre isolados de um mesmo país, como do Brasil. Algumas variações genéticas, em sua maioria SNPs e InDels, foram encontradas em genes codificantes de proteínas de M. leprae com possível papel na imunopatogênese da hanseníase, como no gene ML1334 que codifica uma proteína de membrana não caracterizada. Nesse sentido, este trabalho buscou caracterizar as variantes da proteína ML1334. Primeiramente, ortólogos de outras micobactérias e cepas de M. leprae foram buscados. Análises in sílico foram feitas para compreensão do impacto funcional e estrutural da região variável da proteína. Em seguida, foi realizada a genotipagem do gene ML1334 em amostras brasileiras. Por fim, os diferentes genótipos encontrados foram clonados e expressos em E. coli. As investigações in silico demonstraram alto impacto funcional e estrutural das variações observadas. Adicionalmente, diferenças na imunogenicidade também foram vistas por predições computacionais. A genotipagem de 88 amostras de pacientes com hanseníase MB resultou na detecção de três diferentes genótipos do gene ML1334, sendo um deles, denominado “intermediário”, um achado inédito em amostras brasileiras. A clonagem e expressão das três variantes da proteína foi bem-sucedida, com a fidelidade dos insertos confirmada por sequenciamento. Em conclusão, nossos resultados demonstram que diferenças observadas na proteína ML1334 podem ter impactar no reconhecimento do M. leprae pelo sistema imune, assim como na própria fisiologia bacteriana. O genótipo intermediário encontrado em amostras brasileiras evidencia a necessidade de compreensão do genoma das cepas circulantes no país. As proteínas recombinantes deverão ser usadas em ensaios futuros para caracterização funcional dessas variantes
Resumo em Inglês
Although the first studies involving the etiological agent Mycobacterium leprae revealed a low genetic diversity, more recent works using complete next generation sequencing (WGS) revealed a greater genetic diversity than previously reported, including among isolates from the same country, such as Brazil. Some genetic variations, mostly SNPs and InDels, were found in genes encoding M. leprae proteins with a possible role in the immunopathogenesis of leprosy, such as in the ML1334 gene, which encodes an uncharacterized membrane protein. In this sense, this work characterized the variants of the ML1334 protein. First, orthologs of other mycobacteria and M. leprae strains were searched. In silico analyzes were performed to understand the functional and structural impact of the variable region of the protein. Then, the ML1334 gene was genotyped in Brazilian samples. Finally, the different genotypes found were cloned and expressed in E. coli. In silico investigations demonstrated a high functional and structural impact of the observed variations. Additionally, differences in immunogenicity were also seen by computational predictions. Genotyping resulted in the detection of three different genotypes of the ML1334 gene, one of them being called “intermediate”, an unprecedented finding in Brazilian samples. Cloning and expression of protein variants was successful, with insert fidelity confirmed by sequencing. In conclusion, our results demonstrate that differences observed in the ML1334 protein may have an impact on the recognition of M. leprae by the immune system, as well as on the bacterial physiology itself. The intermediate genotype found in Brazilian samples highlights the need to understand the genome of strains circulating in the country. Recombinant proteins should be used in future assays for functional characterization of these variants
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