Análise da função da RNA helicase EIF4AI na biossíntese proteica de Trypanosoma brucei

Abstract

Pertencente ao complexo heterotrimérico eIF4F, a subunidade eIF4A é uma RNA helicase dependente de ATP, que tem a capacidade de remover estruturas secundárias da região 5’UTR dos mRNAs. Dois homólogos de eIF4A foram identificados em Trypanosoma brucei, EIF4AI e EIF4AIII, sendo o EIF4AI considerado o homólogo funcional na síntese proteica do fator de tradução eIF4A. Apesar do EIF4AI fazer parte de um complexo homólogo de eIF4F em T. brucei, observações mais recentes mostraram que os mRNAs associados a este complexo possuem regiões 5’ UTR curtas, cujas estruturas secundárias talvez não necessitem da atuação de uma RNA helicase. Esse estudo teve por objetivo investigar com mais detalhes as propriedades do EIF4AI de T. brucei, buscando identificar possíveis diferenças funcionais em relação a outros eucariotos. Cinco regiões foram selecionadas para mutagênese sítio-dirigida as quais estão possivelmente relacionadas com a função de helicase, ATPase, e com interações com homólogos de eIF4G ou com o complexo eIF3 (subunidade eIF3i), contudo, ensaios complementares ainda precisam ser feitos para confirmar a real função relacionada a esses motivos. Linhagens transgênicas de T. brucei que expressão o EIF4AI, em sua forma nativa (WT) e mutante (DQAD), foram avaliadas através de ensaios de western blot, levando a detecção de isoformas únicas para cada proteína. Complexos co-precipitados in vivo foram identificados através de espectrometria de massas para ambas as proteínas. Os dados obtidos mostram que o EIF4AI nativo co-precipita com seus parceiros EIF4E4 e EIF4G3, como já descrito. Já o mutante DQAD demonstrou não co-precipitar com estes parceiros, mas sim com os EIF4E3 e EIF4G4, bem como com os complexos eIF3 e eIF2. Ensaios de ancoramento em um mRNA repórter, demonstrou que a proteína nativa levou a um aumento da expressão de GFP quando induzida, diferentemente do observado na proteína mutante. Foi observado que o crescimento celular de células procíclicas de T. brucei foi afetado quando se encontrava na presença de um inibidor de eIF4A (Rocaglamide A) e que este inibia o efeito do EIF4AI nativo no ensaio de ancoramento.