Desenvolvimento e validação de técnica imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal para o diagnóstico da leishmaniose cutânea

Abstract

A leishmaniose tegumentar (LT) continua sendo problema global de saúde pública, que se manifesta principalmente através de lesões cutâneas (leishmaniose cutânea - LC). Na América Latina, o Brasil é o país com maior registro de casos, com várias espécies de Leishmania associadas aos casos humanos. O diagnóstico laboratorial é essencial e um dos grandes desafios para o controle da doença. Desta forma, desenvolvemos e validamos uma técnica de imuno-histoquímica (IHQ) utilizando anticorpo monoclonal (AcMo), para o diagnóstico da LC. Inicialmente, foi realizada uma revisão sistemática a fim de identificar potenciais alvos avaliados para o diagnóstico imunológico da LT. Antígenos com características distintas foram selecionados e considerados promissores para produção do AcMo e aplicação na técnica de IHQ. Os seis antígenos selecionados foram: triparedoxina mitocondrial peroxidase (mTXNPx); homológo do receptor para proteína quinase C ativada (LACK); fosfatase ácida secretada (sAcP); proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11); proteína hipotética (LbPH) e proteína quinase ativada por mitógeno 4 (MAPK4). As sequências de nucleotídeos dos antígenos selecionados foram sintetizadas e inseridas no plasmídeo pET28a. Vetores de clonagem e de expressão foram transformados com os plasmídeos, para produção dos antígenos recombinantes. Os antígenos produzidos foram utilizados como imunógenos em camundongos BALB/c, para produção dos AcMos por meio da técnica de hibridização somática. A imunorreatividade dos AcMos foi avaliada através da técnica de Western blotting, utilizando os respectivos antígenos recombinantes e antígenos solúveis de L. amazonensis, L. braziliensis e L. guyanensis. Em seguida, a técnica de IHQ foi realizada em biópsias de pele de hamsters experimentalmente infectados com estas espécies de Leishmania. A padronização da técnica de IHQ foi realizada utilizando o AcMo anti-mTXNPx e dois sistemas de detecção constituídos por polímero conjugados com as enzimas peroxidase (IHQ-POD) e fosfatase alcalina (IHQ-FA). A validação destes protocolos de IHQ foi relizada em biópsias de pele de 49 pacientes com LC diagnosticados por meio da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), que apresentavam resultados de exame direto e cultura, realizados como diagnóstico de rotina. Foram também incluídos 37 pacientes que apresentando outras doenças dermatológicas infecciosas. O exame histopatológico (HE) e a IHQ foram realizados em todos os pacientes incluídos neste estudo. Na revisão sistemática, foram encontrados potenciais alvos antigênicos para uso em técnicas imunológicas para o diagnóstico de LT, LC e leishmaniose mucosa (LM). No entanto, a maioria dos estudos são provas de conceito, fato que reforça a necessidade de desenvolvimento de estudos de validação mais abrangentes. Através da técnica de Western blotting e IHQ em lesão de animal experimentalmente infectado, foi comprovada a imunorreatividade dos AcMos anti-mTXNPx e anti-LACK. No estudo de validação empregando AcMos anti-mTXNPx, a maior sensibilidade foi observada para IHQ-FA (85,7%), seguida por IHQ-POD (79,6%), exame direto (77,6%), HE (65,3%) e cultura in vitro (49%). IHQ e HE apresentaram especificidade acima de 90%. A positividade do exame direto e da cultura aumentou significativamente quando os resultados foram combinados com da IHQ-FA, atingindo 95,9% e 93,9%, respectivamente. Através da análise de regressão logística verificamos que as técnicas de IHQ e HE são capazes de detectar pacientes com LC independentemente da carga parasitária. Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial da técnica de IHQ para o diagnóstico da LC no Brasil e possibilita o desenvolvimento de novas alternativas diagnósticas para o controle dessa doença negligenciada.