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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/51230
ANTÍGENOS RECOMBINANTES QUIMÉRICOS DO TRYPANOSOMA CRUZI CONJUGADOS À PEROXIDASE E SUA AVALIAÇÃO COMO FERRAMENTA DIAGNÓSTICA DA DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA
Freitas, Natália Erdens Maron de | Date Issued:
2021
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: O ELISA geralmente é o teste de escolha para o diagnóstico da doença de Chagas (DC), no entanto, o seu desempenho depende da preparação antigênica utilizada na fase sólida, podendo levar a resultados falso-positivos e reações cruzadas. A utilização de antígenos recombinantes quiméricos pode superar esta limitação. Quatro antígenos quiméricos do Trypanosoma cruzi (IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4) foram desenvolvidos e avaliados em estudos de fase I e II. Contudo, a utilização de anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com peroxidase, como ocorre na metodologia indireta, limita o uso da técnica para a detecção de anticorpos espécie-específicos e classe-específicos. Para proporcionar a identificação de anticorpos anti-T. cruzi em diferentes espécies através do mesmo ensaio é possível utilizar o próprio antígeno quimérico marcado com peroxidase, utilizando o ELISA sanduíche duplo antígeno (DAS-ELISA). OBJETIVO: Avaliar e validar o desempenho diagnóstico dos antígenos IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 como matrizes antigênicas e agentes de detecção após conjugação à peroxidase, para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi em humanos. MÉTODOS: O DAS-ELISA foi otimizado por checkerboard titration. Para o estudo da fase I (prova de conceito), foram avaliadas 207 amostras positivas e 205 negativas. A reatividade cruzada para outras infecções também foi avaliada utilizando 68 amostras. RESULTADOS: As condições selecionadas para realização dos ensaios foram 25 ng de antígeno, conjugado diluído de 1:2.000 para todas as moléculas e ausência de diluição sérica. No presente estudo, as áreas abaixo da curva dos antígenos IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 foram de 98,7%, 99,5%, 98,6% e 98,8%, respectivamente. Dentre as amostras positivas, o antígeno IBMP-8.1 classificou 53 (25,6%) como falso negativas, o IBMP-8.2, 27 (13%), o IBMP-8.3, 24 (11,6%) e o IBMP-8.4, 43 (20,8%), conferindo valores de sensibilidade de 74,4%, 87%, 88,4% e 79,2%, respectivamente. O único antígeno que não atingiu uma especificidade de 100% foi o IBMP-8.3, com 96,6%. Esta foi também a única molécula a apresentar reatividade cruzada com uma amostra de HTLV. CONCLUSÃO: O DAS-ELISA é uma ferramenta promissora para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi e, apesar dos altos valores de AUC encontrados, o desempenho deste ensaio foi diferente dos valores obtidos pelo nosso grupo ao empregar esses antígenos no ELISA indireto, por este motivo, melhorias serão consideradas para aumentar a sensibilidade do DAS-ELISA no estudo de fase 2.
Abstract
BACKGROUND: Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are generally the chosen test for Chagas disease (CD) diagnosis; however, its performance depends on the antigen preparation adsorbed to the solid phase, which may lead to false-positive results and cross reactions. The use of chimeric recombinant antigens can overcome this limitation. Four chimeric antigens from T. cruzi (IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4) were developed and evaluated in phase I and II studies. However, peroxidase-labeled secondary anti-human IgG antibody, which is employed in indirect ELISAs, limits its use for the detection of species-specific and class-specific antibodies. To overcome this limitation, peroxidase-labeled antigens can be utilized, diagnosing both acute or chronic infection, in a species and immunoglobulin class-independent manner, through the use of a double-antigen sandwich ELISA (DAS-ELISA). OBJECTIVE: Evaluate and validate the diagnostic performance of the chimeric antigens IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 in the DAS-ELISA platform. METHODS: DAS-ELISA was optimized by checkerboard titration. In phase I study, 207 positive and 205 negative samples were evaluated. Cross-reactivity to other infections was also assessed using 68 samples. RESULTS: The selected conditions for the tests utilized 25ng of antigen per well and the conjugate diluted at 1:2,000 for all molecules. In the phase I study, the areas under the curve of IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 were 98.7%, 99.5%, 98.6% and 98.8%, respectively. Among the positive samples, IBMP-8.1 antigen classified 53 (25.6%) as false negative, IBMP-8.2, 27 (13%), IBMP-8.3, 24 (11.6%) and IBMP-8.4, 43 (20.8%), giving sensitivities of 74.4%, 87%, 88.4% and 79.2%, respectively. The only antigen that did not reach 100% specificity was IBMP-8.3, with 96.6%. IBMP-8.3 was also the only molecule to show cross-reactivity with HTLV. CONCLUSION: DAS-ELISA is a promising tool for immunodiagnosis, and despite the high AUC values, the performance of this assay was different from the values obtained by our group when using these antigens in the indirect ELISA, for this reason, improvements are being considered to increase the sensitivity of the DAS-ELISA.
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