Diagnóstico paleoparasitológico molecular de Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758)

Abstract

O parasito humano Ascaris lumbricoides tem distribuição cosmopolita sendo o mais prevalente dos helmintos intestinais. Estudos paleoparasitológicos por microscopia ótica revelaram também que é um dos mais encontrados em material antigo. No entanto são raros os achados desse parasito na América do Sul pré-colombiana. O objetivo desse estudo foi estabelecer uma metodologia de diagnóstico paleoparasitológico molecular de A. lumbricoides que possa ser aplicado diretamente a ADN antigo extraído de coprólitos provenientes de sítios arqueológicos. Inicialmente a metodologia foi padronizada em amostras fecais atuais positivas para A. lumbricoides e/ou outros helmintos e ovos isolados a fim de testar a sensibilidade e especificidade dos métodos diagnósticos. Aos ovos, dois tratamentos foram empregados na extração de ADN: físico (choque térmico) e físico-químico (choque térmico e fenol-clorofórmio). Para as amostras fecais foram usados quatro tratamentos: químico (fenol-clorofórmio), Kit comercial QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen), físico-químico e físico-Kit (choque térmico e Kit comercial). Dois alvos moleculares, o mitocondrial cit b e o nuclear ITS 1, foram usados. Ambos os tratamentos físico e físico-químico disponibilizaram ADN suficiente para a PCR usando-se apenas um ovo para os dois alvos moleculares. O tratamento físico foi essencial para extração de ADN das amostras fecais. O ensaio do RFLP mostrou o perfil esperado para A. lumbricoides. Todas as seqüências nucleotídicas de cit b obtidas dos isolados brasileiros revelaram o nucleotídeo T na posição 5522 característico da espécie A. lumbricoides. Para região ITS 1, 4/5 seqüências nucleotídicas correspondem ao genótipo G1, o mais prevalente na espécie humana. Foram depositadas as primeiras seqüências de A. lumbricoides da América do Sul, assim como este é o primeiro diagnóstico molecular para esse parasito a partir de amostras fecais. As metodologias utilizadas mostram-se aptas em recuperar ADN do parasito a partir dos coprólitos experimentais. Os resultados do RFLP e sequenciamento nucleotídico mostraram que o processo de dessecação artificial não afetou as seqüências nucleotídicas. No trabalho com material arqueológico, as estratégias como PCR reconstrutiva e reamplificação foram essenciais para as amplificações. O diagnóstico paleoparasitológico molecular identificou o parasito em 5 amostras procedentes de sítios arqueológicos sul americanos datados do período pré-colombiano que o exame por microscopia ótica não havia diagnosticado. Todas as 16 seqüências nucleotídicas de cit b obtidas revelaram o nucleotídeo característico da espécie A. lumbricoides, sendo que a maioria das seqüências difere das modernas, afastando a possibilidade de contaminação. Os resultados do diagnóstico paleoparasitológico molecular mostraram uma mudança na paleodistribuição do parasito na América do sul, onde este se estende desde o nordeste de Brasil até o norte do Chile, sendo o achado mais antigo datado de 8800 AP. Pela primeira vez é feito diagnostico molecular de A. lumbricoides diretamente de coprólitos.