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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/50656
ABORDAGENS NO DIAGNÓSTICO DA MALÁRIA: ANÁLISE DA VARIABILIDADE DA PROTEÍNA PFHRP2 E USO DE MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE OBTENÇÃO DE DNA
Molecular diagnosis
Droplet digital PCR
Saliva
Genetic variability
RDT
Costa, Gabriel Luíz | Data do documento:
2021
Autor(es)
Orientador
Coorientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Resumo
A malária é uma doença febril aguda causada por protozoários do gênero Plasmodium. O diagnóstico padrão-ouro é a microscopia óptica (MO), sendo também utilizados os testes rápidos de diagnóstico (RDT). Porém, tais métodos possuem baixo limite de detecção, cerca de 50 parasitos/μL na MO e 100 parasitos/μL no RDT. O diagnóstico com alvos moleculares e metodologias mais sensíveis é capaz de identificar as infecções com baixa densidade parasitária, mesmo em amostras não convencionais como a saliva. Outro fator crítico no diagnóstico de malária é a presença de isolados com deleção do gene que codifica a PfHRP2, proteína presente na maioria dos RDTs. Para suplementar essas limitações do diagnóstico da malária, este estudo teve como objetivo identificar o perfil de deleção e variabilidade do gene pfhrp2, assim como avaliar a performance de dois métodos moleculares, a PCR em tempo real (qPCR) e Droplet Digital PCR (ddPCR), na detecção de DNA do parasito obtido de amostras de sangue, saliva e swab de indivíduos expostos à malária. Uma proporção de 0% a 14,6% de amostras pfhrp2 negativas foi observada nas regiões analisadas, sendo que apenas 1 amostra com deleção de pfhrp2 foi negativa no teste com o RDT. Foram identificados 10 padrões da sequência de PfHRP2, exclusivos de cada região. As taxas de detecção da qPCR e ddPCR foram similares para amostras de sangue, 96 e 98,7%, e saliva, 72,4 e 75%, respectivamente. Porém, a ddPCR foi capaz de detectar 16% a mais de infecções no swab. Ainda assim, a concordância entre as duas técnicas em relação às amostras de swab foi baixa. Uma alta proporção de infecções mistas foi detectada no sangue e saliva. Este projeto se torna relevante na padronização de protocolos moleculares sensíveis a baixas parasitemias, utilizando fontes alternativas para obtenção de DNA, assim como no monitoramento das taxas de deleção e variabilidade do gene pfhrp2, fator importante na sensibilidade dos RDT utilizados no sistema de saúde.
Resumo em Inglês
Malaria is an acute febrile disease caused by the protozoan of the genus Plasmodium. The gold standard malaria diagnosis is the light microscopy (LM), also being used the rapid diagnostic tests (RDT). However, such methods have a low limit of detection, around 50 parasites/μL in LM and 100 parasites/μL in RDT. The diagnosis using molecular targets and more sensitive methodologies is capable of identification of low parasite density infections, even in non-conventional samples, as saliva. Another critical factor in malaria diagnosis is the presence of isolates harboring the deletion of the gene that encodes the PfHRP2, protein present in most of RDTs. To supplement the limitations of malaria diagnosis, this study had as objective identify the deletion and variability profile of pfhrp2 gene, as well as evaluate the performance of two molecular methods, Real-time PCR (qPCR) and Droplet Digital PCR (ddPCR), in detection of parasite DNA obtained from blood, saliva and buccal swab samples of individuals exposed to malaria. A proportion of 0% to 14,6% of pfhrp2 negatives samples was observed in all regions analyzed, where only 1 sample with pfhrp2 deletion was RDT negative. Ten PfHRP2 patterns were identified, exclusive in each region. The qPCR and ddPCR detection rates were similar to blood samples, 96 and 98,7%, and saliva, 72,4 and 75%, respectively. However, the ddPCR was capable of detection of 16% more infections in buccal swab samples. Nevertheless, the concordance between the two methods and the buccal swab samples was low. A high proportion of mixed infections was detected in blood and saliva. This study becomes relevant in the standardization of sensitive molecular protocols to low parasitemias, using alternative sources to obtain DNA, as well as in surveillance of pfhrp2 deletion and variability rates, crucial factor in RDT sensibility.
Palavras-chave em inglês
MalariaMolecular diagnosis
Droplet digital PCR
Saliva
Genetic variability
RDT
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