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AVALIAÇÃO E VALIDAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DO TREPONEMA PALLIDUM PARA O IMUNODIAGNÓSTICO DA SÍFILIS
Silva, Ângelo Antonio Oliveira | Data do documento:
2020
Autor(es)
Orientador
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Resumo
INTRODUÇÃO: A sífilis é uma infecção sexualmente transmissível (IST) causada pela bactéria Treponema pallidum, que se caracteriza por ser crônica, multissistêmica e restrita aos seres humanos. É um problema de saúde pública, considerada como a mais importante infecção que afeta gestantes e recém-nascidos. O diagnóstico laboratorial é realizado com testes sorológicos não-treponêmicos (VDRL e RPR) e testes treponêmicos (ELISA, QML e IFI). Dentre os treponêmicos, os imunoenzimáticos apresentam bom desempenho, a depender da preparação antigênica utilizada. Desta forma, proteínas recombinantes fornecem maior confiabilidade aos resultados por melhorarem a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade dos imunoensaios. OBJETIVO: Avaliar o potencial diagnóstico das proteínas recombinantes TpN17, TpN47, TpN15 e TmpA do T. pallidum para o diagnóstico laboratorial da sífilis. MATERIAL E MÉTODOS: As proteínas foram produzidas e purificadas no Instituto de Biologia Molecular do Paraná. Os ensaios de ELISA indireto foram padronizados e otimizados através de checkerboard titration para determinar a quantidade ideal de antígeno, anticorpo secundário e amostras séricas, utilizando 4 pools negativos e 3 pools positivos em duplicata. Para o estudo de fase I, 653 amostras séricas foram consideradas elegíveis, sendo 143 positivas para sífilis, 301 negativas e 209 positivas para outras doenças infecto-parasitárias. As amostras foram reavaliadas para a presença ou ausência de anticorpos para sífilis, com testes não-treponêmicos (USR e RPR) e/ou treponêmicos (FTA-ABS - IIFT IgG). RESULTADOS: Na padronização, a maior diferença do sinal entre as amostras positivas e negativas foi atingida utilizando as seguintes condições: TpN17 e TpN47 (100 ng do antígeno, 1:25 do soro e 1:20.000 do conjugado) e TmpA (200 ng do antígeno, 1:25 do soro e 1:10.000 do conjugado). Não foi possível padronizar a molécula TpN15, provavelmente devido a problemas de expressão e purificação, e por isto ela foi desconsiderada do estudo. No estudo de fase I, TpN17, TmpA e TpN47 obtiveram área abaixo da curva (AUC) de 97,2%, 91,8% e 81,6%, respectivamente. A TpN17 e TmpA apresentaram especificidade de 100% enquanto a TpN47 obteve 99,7%. Todavia, do quantitativo de amostras positivas, a TpN17 e a TmpA diagnosticaram 43 amostras como falso-negativas, resultando em sensibilidade de 69,9%. Já a TpN47, diagnosticou 66 amostras como falso-negativas, apresentando sensibilidade de 53,8%. Na determinação do índice de reatividade cruzada, foi observada reatividade de 2,9% (6/209) para a TpN17 (leptospirose: 6) e 16,74% (35/209) tanto para a TmpA (leptospirose: 32; dengue: 1; filariose: 1; esquistossomose: 1) quanto para a TpN47 (leptospirose: 32; filariose: 1; HIV: 2). No ensaio de reprodutibilidade intra-placa não houve diferença significativa entre as moléculas, apresentando assim uma boa repetitividade dos ensaios. CONCLUSÃO: A despeito dos baixos valores de sensibilidade reportados, as proteínas mostraram elevada capacidade diagnóstica em virtude dos valores de AUC encontrados. Contudo, uma melhora na sensibilidade pode ser alcançada quando misturas antigênicas forem avaliadas, consistindo na próxima etapa de nossa investigação.
Resumo em Inglês
INTRODUCTION: Syphilis is a life-long, multisystemic, human-specific sexually transmitted infection (STI), caused by the spirochete bacterium Treponema pallidum. It is a public health problem and the most important infection among pregnant women and newborns. Laboratory diagnosis is performed through non-treponemal serological tests (VDRL and RPR) and treponemal tests (ELISA, CLIA and IIF). Among the treponemal tests, the immunoenzymatic assays are regarded as efficient, however, its efficiency relies on the employed antigen preparation. Thus, recombinant proteins provide greater reliability to results by improving immunoassay sensitivity, specificity, and reproducibility. AIM: To evaluate the diagnostic potential of the recombinant T. pallidum proteins TpN17, TpN47, TpN15 and TmpA for syphilis serodiagnosis. MATERIALS AND METHODS: The proteins were produced and purified at the Institute of Molecular Biology of Paraná. Indirect ELISA was standardized and optimized by checkerboard titration to determine the appropriate antigen amount, secondary antibody and serum dilutions, by assessing 4 negative and 3 positive pools. All standardization assays were undertaken in pairs. For the phase I study, 653 serum samples were considered eligible, being 143 positive for syphilis, 301 negative and 209 positive samples for other parasitic diseases. The samples were reassessed for the presence or absence of syphilis antibody by non-treponemal (USR and RPR) and treponemal (FTA-ABS) tests. RESULTS: In standardization, the greatest signal difference between positive and negative samples was achieved using the following conditions: TpN17 and TpN47 (100 ng of antigen, 1:25 of serum and 1:20,000 of conjugate) and TmpA (200 ng of antigen, 1:25 serum and 1:10,000 conjugate). Standardization of TpN15 was not achieved, probably due to issues regarding protein expression and/or purification, therefore, it was omitted from the study. In the phase I study, the area under the ROC curve (AUC) for TpN17, TmpA and TpN47 was 97.2%, 91.8% and 81.6% respectively. TpN17 and TmpA had 100% of specificity, followed by TpN47 with 99.7%. However, TpN17 and TmpA provided a negative result for 43 syphilis-positive samples, resulting in sensitivity of 69.9%. TpN47, concurrently, rendered negative results for 66 syphilis-positive samples, which lowered its sensitivity to 53.8%. All three antigens cross-reacted in varying amounts. In regard to non-specific reactions, TpN17 recognized 2.9% (6 (leptospirosis)/209) of the samples as positive for syphilis, followed by TpN47 (leptospirosis: 32; filariasis: 1; HIV: 2) and TmpA (leptospirosis: 32; dengue: 3), both misdiagnosing 35/209 samples, resulting in 16.74% of cross-reactivity. No significant difference in performance was found in the intra-plate reproducibility assessment. CONCLUSION: Despite the sensitivity values found, these proteins showed a high diagnostic capacity based on their AUC values. Nevertheless, sensitivity can be improved by employing antigen mixtures, which shall be the next step in our investigation.
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