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EFEITOS DOS FIBROBLASTOS ASSOCIADOS AO CÂNCER E DO BLOQUEIO FARMACOLÓGICO DE GLI NA INVASÃO E MIGRAÇÃO EM CÉLULAS DE CARCINOMA ESCAMOCELULAR DE BOCA
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Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: Os cânceres de boca são um problema de saúde pública devido à alta incidência, prevalência e mortalidade. Dentre estes, o carcinoma escamocelular de boca (CEB) é o subtipo histológico mais comum. A via Hedgehog (Hh) já foi descrita em diversos tipos de cânceres, e sua ativação desencadeia a expressão de genes que regulam a proliferação, a angiogênese e a invasão tumoral. A percepção do câncer tem sido ampliada e compreendida em um contexto de microambiente, no qual os fibroblastos associados ao câncer (CAF, do inglês, carcinoma-associated fibroblasts) têm sido relacionados com a progressão tumoral. OBJETIVO: Avaliar o efeito de CAF na expressão de genes Hh em célula de CEB, bem como analisar se o bloqueio farmacológico desta cascata sinalizadora, em CAF, pode ter efeito na expressão de genes relacionados a cascata Hh, migração e invasão em célula CEB. MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizadas linhagens de CEB (CAL27, SCC4, SCC9 e HSC3), culturas primárias de fibroblastos normais de boca (NOF) e CAF de boca (CAF). Em células de CEB e fibroblastos, foram realizadas imunofluorescência, western blot e expressão gênica para caracterização da via Hh nesses tipos celulares. Em amostras de CEBs humanos, foi realizada a imuno-histoquímica para os anticorpos \03B1-SMA, SHH, IHH, MMP9 e MMP14. As células HSC3 e CAL27 foram estimuladas com o SHH recombinante e analisada a expressão dos genes componentes da via Hh. Para bloqueio farmacológico da via Hh, foi utilizado o GANT61 em CAF e CAL27. Foi coletado meio condicionado por CAFs e por CAFs com a via Hh bloqueada, com o qual as células CAL27 foram incubadas, e avaliada a expressão de genes relacionados à via Hh, invasão e migração celular. RESULTADOS: Em CEBs humanos, foi encontrada uma forte correlação positiva entre fibroblastos \03B1-SMA+ e as proteínas SHH e MMP9, na região de front tumoral. A expressão gênica de componentes da via Hh foi observada nas linhagens de CEB, bem como em NOF e em CAF. Nas linhagens de células tumorais (HSC3 e CAL27) e no CAF, foi observada a marcação de proteínas da via Hh. Após estímulo com SHH recombinante, as células HSC3 e CAL27 apresentaram uma maior expressão dos genes PTCH1 e GLI1. Em CAL27, a incubação com o meio condicionado por CAFs foi capaz de aumentar os níveis de transcritos de RNAm de genes da via Hh e genes envolvidos na migração e invasão celular, como MMP9, MMP14, Osteopontina, E-caderina e \03B2-catenina. Após o bloqueio da via, observou-se uma interrupção no aumento da expressão dos genes supracitados, nos diferentes tempos estudados. CONCLUSÕES: Os CAFs são fontes de ligantes Hh e regulam a via Hh nas células de CEB, através da sinalização parácrina reversa. O meio condicionado por CAFs aumenta a expressão de genes relacionados à migração e invasão celular, favorecendo a progressão do CEB. E ainda, o bloqueio farmacológico dos CAFs e CAL27 diminui a expressão desses genes. Adicionalmente, a via Hh pode ser considerada um potencial alvo farmacológico no CEB.
Abstract
INTRODUCTION: Oral cancers are a public health problem due to their high incidence, prevalence and mortality. Among these, the oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common histological subtype. The Hedgehog pathway (Hh) has been identified in several types of cancers, and its activation triggers the expression of genes that regulate proliferation, angiogenesis and tumor invasion. The understanding of cancer has been expanded and adapted to a microenvironment context, in which cancer-associated fibroblasts (CAFs) have been linked to tumor progression. AIMS: To evaluate the effect of CAF on Hh gene expression in OSCC cells, as well as to analyze if the pharmacological blockade of this signaling cascade in CAF may have effect on the expression of Hh cascade related genes, migration and invasion in OSCC cells. MATERIAL AND METHODS: OSCC cell lines (CAL27, SCC4, SCC9 and HSC3), primary cultures of normal oral fibroblasts (NOF) and oral CAF (CAF) were used. In OSCC cells and fibroblasts, immunofluorescence, western blot and gene expression were performed to characterize the Hh pathway in these cell types. In human OSCC samples, immunohistochemistry for \03B1-SMA, SHH, IHH, MMP9 and MMP14 antibodies was performed. HSC3 and CAL27 cells were stimulated with recombinant SHH and expression of Hh pathway component genes was analyzed. For the pharmacological blockade of the Hh pathway, GANT61 in CAF and CAL27 was used. Medium conditioned by CAF with and without blockage of the Hh pathway were collected, in which CAL27 cells were incubated, and expression of Hh pathway-related genes, invasion and cell migration were evaluated. RESULTS: In human OSCCs, a strong positive correlation was found between \03B1-SMA+ fibroblasts and SHH and MMP9 proteins in the tumor front region. The gene expression of Hh pathway components was observed in OSCC cell lines, as well as NOF and CAF. In tumor cell lines (HSC3 and CAL27) and CAF, protein staining of the Hh pathway was observed. After stimulation with recombinant SHH, HSC3 and CAL27 cells showed a higher expression of PTCH1 and GLI1 genes. In CAL27 cells, incubation with CAFs conditioned medium was able to increase mRNA transcript levels of Hh pathway genes and genes involved in cell migration and invasion such as MMP9, MMP14, Osteopontin, E-cadherin and \03B2-catenin. After blockade of the Hh pathway, much of this effect was reversed. CONCLUSIONS: CAFs are sources of Hh ligands and regulate the Hh pathway in OSCC cells through reverse paracrine signaling. CAFs-conditioned medium increases the expression of genes related to cell migration and invasion, favoring the progression of OSCC. Moreover, pharmacological blockade of CAFs and CAL27 decreases the expression of these genes. Additionally, the Hh pathway can be considered a potential pharmacological target in OSCC.
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