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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS BRUTOS E SUBSTÂNCIAS, OBTIDOS DE PLANTAS E DE FUNGOS, CONTRA OS VÍRUS DENGUE, ZIKA E CHIKUNGUNYA
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Resumo
O Dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV) e o Chikungunya virus (CHIKV) são arbovírus amplamente distribuídos em países tropicais e subtropicais e são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A febre hemorrágica causada pelo DENV, a microcefalia e anormalidades neurológicas em recém nascidos causadas pelo ZIKV e cronificação de artralgia grave causada pelo CHIKV, despertaram a urgência para a busca de vacinas e drogas antivirais efetivas para a prevenção e tratamento de infecções causadas por esses vírus. Visto que natureza fornece um vasto reservatório de entidades químicas complexas, neste trabalho foi feito o fracionamento biomonitorado de extratos brutos de vegetais e de fungos com atividade antiviral contra pelo menos um dos vírus aqui estudados para identificação e isolamento de substâncias antivirais. Para tal foram utilizadas técnicas como UPLC/HPLC acoplada à espectrometria de massas. Mais de 6.000 frações obtidas no fracionamento foram testadas contra DENV-2 e ZIKV. Paralelamente foram testados novos extratos brutos contra DENV-2, ZIKV e CHIKV, a saber: (i) 4.000 extratos testados contra DENV-2, dentre os quais identificamos 61 extratos vegetais e 129 extratos fúngicos ativos; (ii) 1.107 extratos testados contra ZIKV, identificando-se como ativos, 28 vegetais e 20 fúngicos; (iii) 565 contra o CHIKV, resultando em 20 extratos vegetais e 13 extratos fúngicos ativos. A atividade antiviral in vitro de extratos/frações foi feita pelo método do MTT, visualização do efeito citopático (ECP) viral por microscopia óptica e por ensaios virucidas. Onze extratos de fungos endofíticos foram ativos contra os 3 vírus. Oitenta e nove extratos fúngicos apresentaram valores de índice de seletividade (IS) de 1 a > 500, sendo que, dentre os 51 extratos testados, 49 apresentram atividade virucida contra o DENV-2. Onze extratos fúngicos demonstraram IS de > 1,0 a 4,0 contra o ZIKV. O fracionamento de 20 extratos fúngicos sugeriu a presença de 12 substâncias em frações ativas contra DENV-2. Uma substância clorada ativa contra DENV-2 e ZIKV (C19H17ClN2O7) está em processo de isolamento. Extratos vegetais obtidos de plantas de 39 famílias foram ativos contra DENV-2, sendo que extratos de espécies pertencentes às famílias Amaryllidaceae, Begoniaceae, Calophyllaceae, Fabaceae, Lythraceae, Malpighiaceae, Rubiaceae e Sapindaceae foram ativos contra DENV-2, ZIKV e CHIKV. Quarenta e cinco extratos vegetais demonstraram valores de IS de 1,1 a 61,8 contra DENV-2 e IS de > 1,0 a 5,2 contra ZIKV. Extratos obtidos de espécies de Amaryllidaceae, Fabaceae e Orchidaceae geraram extratos não virucidas contra DENV-2 e ZIKV. O fracionamento de 15 extratos de espécies de Amaryllidaceae, Fabaceae e Orchidaceae permitiu a identificação de 25 substâncias em frações ativas contra DENV-2 e/ou ZIKV. Entre elas, a licorina, pretazetina, narciclasina e a narciclasina-4-O-β-D-xilopiranosídeo, cuja identidade foi confirmada de forma inequívoca por ressonância magnética, mostraram atividade antiviral não virucida, com IS de 3,7 a 8,6 contra DENV-2 e ZIKV. Derivados mono- e di- acetilados de licorina, obtidos por síntese química, foram menos citotóxicos, porém inativos contra DENV-2, ZIKV e CHIKV. Quando combinadas em diversas concentrações, a licorina e a pretazetina não apresentaram potenciação da atividade antiviral. A predição in silico, pela plataforma pkCSM, dos perfis de farmacocinética e de toxicidade (ADMET) mostrou que a licorina, pretazetina, narciclasina e narciclasina-4-O-β-D-xilopiranosídeo têm boa metabolização e não possuem toxicidade mutagênica; A licorina e a pretazetina foram preditas com melhor absorção oral, distribuição e excreção, sugerindo que ambas podem ser candidatas para testes em modelo animal. Em suma, neste trabalho foram identificadas 37 substâncias derivadas de plantas e de fungos como possíveis antivirais. Vale ressaltar que nenhuma delas já foi descrita com atividade contra o ZIKV.
Resumo em Inglês
Dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV) and Chikungunya virus (CHIKV) are arboviruses widely distributed in tropical and subtropical countries and are the leading causes of morbidity and mortality worldwide. DENV hemorrhagic fever, microcephaly and neurological abnormalities in newborns caused by ZIKV, and severe chronic arthralgia caused by CHIKV, have called for urgent search for effective vaccines and antiviral drugs for the prevention and treatment of infections caused by these viruses. Since nature provides a vast reservoir of complex chemical entities, in our study, to identify and isolate antiviral substances against DENV-2; ZIKV and CHIKV, we performed the bioguided fractionation of crude extracts of plants and fungi with antiviral activity against at least one of the viruses studied here, by using UPLC/HPLC coupled to mass spectrometry. The in vitro antiviral activity of extracts/fractions was done by the MTT method, visualization of viral cytopathic effect (ECP) by optical microscopy and virucidal assays. More than 6,000 extract fractions were tested against DENV-2 and ZIKV. In addition, new crude extracts against the three viruses, namely: (i) 4,000 extracts against DENV-2, among which we identified 61 plant extracts and 129 active fungal extracts; (ii) 1,107 against ZIKV, identifying 28 plant extracts and 20 active fungal and; (iii) 565 against CHIKV, resulting in 20 plant extracts and 13 active fungal. Eleven extracts from endophytic fungi were active against the 3 viruses. Eighty-nine fungal extracts showed selectivity index (IS) values ranging from 1 to > 500, and among the 51 extracts tested 49 showed virucidal activity against DENV-2. Eleven fungal extracts showed IS of > 1.0 to 4.0 against ZIKV. The fractionation of 20 fungal extracts suggested the presence of 12 substances in active fractions against DENV-2. A chlorinated substance active against DENV-2 and ZIKV (C19H17ClN2O7) is being isolated. Plant extracts obtained from plants of 39 families were active against DENV-2, and extracts from species of Amaryllidaceae, Begoniaceae, Calophyllaceae, Fabaceae, Lythraceae, Malpighiaceae, Rubiaceae and Sapindaceae were active against DENV-2, ZIKV and CHIKV. Forty-five plant extracts showed IS values from 1.1 to 61.8 against DENV-2; and IS from > 1.0 to 5.2 against ZIKV. Extracts obtained from species of Amaryllidaceae, Fabaceae and Orchidaceae were non-virucidal extracts against DENV-2 and ZIKV. The fractionation of 15 extracts of Amaryllidaceae, Fabaceae, Orchidaceae species allowed the identification of 25 substances in active fractions against DENV-2 and / or ZIKV. Among them, lycorine, pretazettine, narciclasine and narciclasine-4-O-β-D-xylopyranoside, whose identity was unequivocally confirmed by nuclear magnetic resonance, showed non-virucidal antiviral activity, with IS = 3.7 to 8.6 against DENV-2 and ZIKV. Mono- and di-acetylated lycorine derivatives obtained by chemical synthesis were less cytotoxic but inactive against DENV-2, ZIKV and CHIKV. When combined in various concentrations, lycorin and pretazettine did not show potentiation of antiviral activity. The pkCSM platform for in silico of pharmacokinetic and toxicity profiles (ADMET) suggested (i) lycorine, pretazettine, narciclasine and narciclasine-4-O-β-D-xylopyranoside with good metabolism and no mutagenic toxicity; (ii) lycorine and pretazettine with better oral absorption, distribution and excretion suggesting that both may be candidates for animal model testing. In summary, 37 substances derived from plants and fungi were identified as possible antivirals. It is noteworthy that none of them have been described with activity against ZIKV.
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