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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/48362
DESENVOLVIMENTO DE NOVO MÉTODO SOROLÓGICO PARA O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA INFECÇÃO HUMANA PELO HTLV-1/2 EMPREGANDO PLATAFORMA ÚNICA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS IGG1 POR CITOMETRIA DE FLUXO
Paiva, Luciene Pimenta de Paiva | Date Issued:
2020
Co-advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa De Pós-Graduação Ciências da Saúde. Belo Horizonte, MG, Brasil
Abstract in Portuguese
O HTLV (Human T-lymphotropic virus) é o primeiro retrovírus descoberto associado a doenças em humanos. Existem mais de 10 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo, sendo o Brasil, globalmente, o país com o maior número absoluto de casos da infecção. Aproximadamente 95 a 98% dos indivíduos infectados pelo HTLV permanecem assintomáticos, no entanto, 2 a 5% dos infectados podem desenvolver manifestações clínicas graves. Enquanto a infecção pelo HTLV-1 pode se manifestar com doenças de alta gravidade, como a Mielopatia Associada ao HTLV ou Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), o HTLV-2 é associado predominantemente com quadros benignos e doença assintomática. Apesar da importância clínica de se distinguir a infecção pelo HTLV-1 e HTLV-2, existe uma atual escassez de métodos de tipagem capazes de distinguir anticorpos gerados para estes dois tipos virais. Desta forma, este trabalho teve como foco o desenvolvimento de um novo método sorológico, denominado FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2), baseado em um protocolo de marcação fluorescente diferencial, utilizando Alexa Flúor-647, de linhagens celulares infectadas pelo HTLV-1 (MT-2) e HTLV-2 (MoT) para análise seletiva simultânea empregando plataforma única por citometria de fluxo. Por meio do FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) foi possível avaliar a reatividade de anticorpos IgG1 anti-HTLV-1/2 em amostras de soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1/2 e doadores saudáveis com alta sensibilidade e especificidade no diagnóstico universal e diferencial da infecção. A metodologia desenvolvida apresentou alta estabilidade da marcação fluorescente diferencial e da antigenicidade das linhagens celulares MT-2 e MoT em diferentes condições (TA, 4ºC e -20ºC) e tempos (2, 6 e 12 meses) de armazenamento. Utilizando um algoritmo de decisão assincrônico, foi possível realizar o diagnóstico diferencial da infecção pelo HTLV-1/2 empregando a metodologia FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2). Por fim, a avaliação do desempenho de FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) indicou potencial para o prognóstico da infecção pelo HTLV-1. A metodologia permitiu o depósito de patente, o que define o potencial inovador de FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) no diagnóstico universal e diferencial da infecção pelo HTLV-1/2. De nosso conhecimento, esta é a primeira estratégia sorológica, além do Western Blot, capaz de segregar indivíduos infectados pelo HTLV-1 e HTLV-2, empregando plataforma única para pesquisa de anticorpos IgG1 por citometria de fluxo.
Abstract
HTLV (Human T-lymphotropic virus) is the first retrovirus discovered associated with disease in humans. There are more than 10 million people infected worldwide, with Brazil being the country with the highest absolute number of cases of infection globally. Approximately 95 to 98% of individuals infected with HTLV remain asymptomatic, however, 2 to 5% of those infected may develop severe clinical manifestations. While HTLV-1 infection can manifest itself with highly serious diseases, such as HTLV-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), HTLV-2 is predominantly associated with benign conditions and asymptomatic clinical course. Despite the clinical importance of distinguishing HTLV-1 and HTLV-2 infection, there is a current shortage of typing methods capable of distinguishing antibodies generated for these two viral types. Thus, this work focused on the development of a new serological method, called FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2), based on a differential fluorescent labeling protocol, using Alexa Fluor 647, of cell lines infected by HTLV- 1 (MT-2) and HTLV-2 (MoT) for simultaneous selective analysis using a single flow cytometry platform. Through FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2), it was possible to evaluate the reactivity of IgG1 anti-HTLV-1/2 antibodies in serum samples from individuals infected with HTLV-1/2 and healthy donors with high sensitivity and specificity in the universal and differential diagnosis of the infection. The developed methodology showed high stability of the differential fluorescent labeling and antigenicity of the MT-2 and MoT cell lines under different conditions (TA, 4ºC and -20ºC) and storage times (2, 6 and 12 months). Using an asynchronous decision algorithm, it was possible to perform the differential diagnosis of HTLV-1/2 infection using the FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) methodology. Finally, the performance evaluation of FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) indicated potential for the prognosis of HTLV-1 infection. The methodology allowed the patente request deposit, which defines the innovative potential of FC-Duplex IgG1 (HTLV-1/2) in the universal and differential diagnosis of HTLV-1/2 infection. To our knowledge, this is the first serological strategy, in addition to western blotting, capable of segregating individuals infected by HTLV-1 and HTLV-2, using a single platform for IgG1 antibody testing by flow cytometry.
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