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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44362
EFEITO ANTIVIRAL DO FLAVONÓIDE NARINGENINA SOBRE CÉLULAS HUMANAS INFECTADAS COM ZIKA VÍRUS
Cataneo, Allan Henrique Depieri | Data do documento:
2020
Autor(es)
Orientador
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
O Zika vírus (ZIKV) é o agente causador de uma arbovirose emergente transmitido principalmente através da picada de mosquitos do gênero Aedes spp. O vírus pertence ao gênero Flavivirus, da família Flaviviridae, da qual fazem parte outros vírus de relevância para a saúde pública, como o vírus da dengue, febre amarela e vírus do oeste do Nilo. A infecção pelo ZIKV em humanos é caracterizada por uma doença autolimitada apresentando como sintomas mais frequentes febre baixa, mialgia, exantema, artralgia, dor de cabeça, dor de garganta e vômito. No entanto, manifestações neurológicas após infecção por ZIKV foram observadas nas recentes epidemias da Polinésia Francesa (2013) e do Brasil (2015-2016). Em adultos, síndrome de Guillain-Barré, e em crianças nascidas de mães infectadas anormalidades no desenvolvimento do sistema nervoso central e microcefalia, posteriormente denominada de Síndrome Congênita do Vírus Zika. Apesar da redução nos casos de febre do ZIKV nos últimos anos, o vírus continua em circulação no Brasil, podendo causar novas epidemias. Adicionalmente, cerca de 61 países estão sob risco de novos surtos, uma vez que o inseto vetor está presente nessas regiões. Considerando o exposto, a busca por moléculas com atividade antiviral é de grande importância. Entre os compostos naturais, os flavonóides representam uma classe de compostos com ampla atividade biológica/farmacológica, incluindo atividade antiviral. Portanto, neste estudo foi realizada a avaliação in vitro da atividade antiviral do flavonóide naringenina (NAR) contra ZIKV. Adicionalmente, neste trabalho foi reportado a identificação de um vírus inseto-específico contaminando cepas de ZIKV. Ainda, foram descritos protocolos in vitro e in vivo para eliminar o contaminante dos isolados de ZIKV, uma vez que estes podem interferir com os estudos de atividade antiviral. Com base na atividade antiviral da NAR contra os quatro sorotipos do vírus da dengue, e levando-se em conta a similaridade genética entre dengue e ZIKV, foi avaliada a atividade anti-ZIKV da NAR in vitro. Através de técnicas como citometria de fluxo, imunodetecção por foco, imunofluorescência e RT-qPCR demonstrou-se que a NAR exerce atividade anti-ZIKV de forma dose-dependente. Os resultados demonstram que o efeito anti-ZIKV da NAR é linhagem-independente, tendo efeito contra cepas da linhagem Asiática e Africana do vírus. Além disso, o efeito anti-ZIKV da NAR foi demonstrado em diferentes tipos celulares, incluindo uma linhagem de célula humana neuronal (A172) e células dendríticas derivadas de monócitos humanos (hmdDCs). Os ensaios de tempo de adição da droga sugerem que a NAR atue na inibição da replicação viral, uma vez que o efeito foi observado apenas quando o tratamento foi realizado após a infecção. A análise por docking molecular reforça essa hipótese ao demonstrar que a NAR é capaz de se ligar à protease viral (NS2B-NS3). Ainda, observou-se que adição de cadeias de hidrocarbonetos na molécula de NAR apesar de aumentar a atividade anti-ZIKV mostrou-se mais tóxica para as células, sem efeito aditivo ao índice de seletividade. Desta forma, os dados sugerem que a NAR pode ser uma molécula promissora no desenvolvimento de moléculas anti-ZIKV e futuros estudos pré-clínicos devem ser realizados. Por fim, moléculas sintéticas derivadas da NAR foram testadas na tentativa de reduzir a toxicidade e melhorar o efeito anti-ZIKV, no entanto, dentre as 18 moléculas testadas nenhuma foi mais eficaz que a NAR.
Resumo em Inglês
Zika virus (ZIKV) is an emerging arbovirus transmitted through the bites of Aedes spp mosquitoes. The virus belongs to the genus Flavivirus, from the Flaviviridae family, which includes other viruses of public health relevance, such as dengue virus, yellow fever and West Nile virus. A self-limiting disease with incubation of approximately 10 days characterizes ZIKV infection in humans. The most characteristic signs and symptoms are low fever, myalgia, rash, arthralgia, headache and less often edema, sore throat and vomiting. Unlike dengue infection, ZIKV fever appears less severe, with a milder head and body ache than dengue, and no bleeding and hypovolemic shock are reported. However, cases of Guillain-Barré Syndrome have been reported in ZIKV-infected patients in French Polynesia. Recently, ZIKV has been associated with cases of abnormalities in central nervous system development and microcephaly in newborns, especially in Brazil, later known as Congenital Zika Virus Syndrome. Despite the reduction in ZIKV fever cases in Brazil, around 61 countries are at risk of further outbreaks, since the vector insect is present in these regions. Given the above, the search for antiviral molecules is extremely important. Among natural compounds, flavonoids have been studied in a variety of pathological conditions, including as potential antiviral molecules. Therefore, the in vitro antiviral potential of the flavonoid naringenin (NAR) against ZIKV was performed. Additionally, this work reports the identification and elimination of an insect-specific virus contaminant in ZIKV laboratory strains that would be used in antiviral assays. The contamination of ZIKV strains was detected using molecular biology and immunofluorescence techniques. Since contaminants may influence the results obtained, we propose protocols to eliminate the contaminating virus from ZIKV strains. The elimination of the contaminant was performed by successive passage in vertebrate cell line or by inoculation in mice, aiming to guarantee the quality of the strains before the antiviral tests. Based on the antiviral activity of NAR against the four serotypes of dengue virus, and taking into account the genetic similarity between dengue and ZIKV, the in vitro anti-ZIKV effect of NAR was evaluated. Through techniques such as flow cytometry, focus immunodetection, immunofluorescence and RT-qPCR we demonstrated that NAR exerts anti-ZIKV activity in a dose-dependent manner. The results demonstrate that the effect remains on different strains and strains of ZIKV. In addition, the anti-ZIKV effect of NAR has been demonstrated in different cell types, including a human neuronal cell line (A172) and human monocyte-derived dendritic cells (hmdDCs). The time of drug-addition assays suggested that NAR acts inhibiting viral replication, as the effect was observed only when treatment was performed after infection. Molecular docking analysis reinforces this hypothesis by demonstrating that NAR is capable of binding to NS2b-NS3 viral protease. Thus, the data suggest that NAR may be a promising molecule in the development of antivirals, and further studies in preclinical trials are needed. Finally, we decided to test synthetic molecules derived from NAR in an attempt to reduce toxicity and improve the anti-ZIKV effect, however, among the 18 molecules tested none was more effective than NAR.
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