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ANÁLISE DA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS-TRONCO OBTIDAS DE TECIDO ADIPOSO HUMANO DURANTE A DIFERENCIAÇÃO ADIPOGÊNICA E OSTEOGÊNICA E ESTUDO DO PAPEL DA HELICASE DDX6 NESTE PROCESSO
Adipose Tissue
Gene Expression Regulation
Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein Group M
RNA, Messenger
Tejido Adiposo
Regulación de la Expresión Génica
Ribonucleoproteína Heterogénea-Nuclear Grupo M
ARN Mensajero
Tecido Adiposo
Regulação da Expressão Gênica
Ribonucleoproteínas Nucleares Heterogêneas Grupo M
RNA Mensageiro
Marcon, Bruna Hilzendeger | Fecha del documento:
2019
Director
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumen en portugues
As células-tronco obtidas de tecido adiposo humano (hASCs) são consideradas uma alternativa interessante para uso na medicina regenerativa e a compreensão de como se dá o balanço entre a manutenção de seu estado indiferenciado e o início da diferenciação é um passo importante para melhor aproveitar seu potencial. Dentre os mecanismos envolvidos neste processo, está a regulação do ciclo de vida dos transcritos, que envolve a ação de proteínas de ligação ao RNA, como a helicase DDX6. Em uma tese de Doutorado desenvolvida previamente em nosso grupo, observou-se que a redução da expressão desta proteína em hASCs (através do uso de RNAi) levou à aceleração da diferenciação adipogênica, com um maior acúmulo de lipídeos. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar a regulação da expressão gênica em hASCs durante as primeiras 24 horas de diferenciação adipogênica e osteogênica e avaliar o papel da helicase DDX6 neste processo. Para isso, foi primeiramente realizado o sequenciamento do RNAm total e das frações associadas a monossomos e polissomos de hASCs mantidas em meio não-indutor ou tratadas com meio de indução adipogênica ou osteogênica por 24 horas. A análise dos dados revelou que, em ambos os processos de diferenciação, houve uma importante regulação da expressão, sendo que na osteogênese houve um predomínio de genes regulados positivamente, enquanto que na adipogênese a maior parte dos genes diferencialmente expresso teve regulação negativa. Também se observou que, após 24 horas de indução adipogênica, já foi possível verificar mudanças na expressão de genes relacionados com a diferenciação, o que não ocorreu na osteogênese, sugerindo que o comprometimento com a diferenciação é mais precoce na adipogênese em hASCs. Além disso, após 24 horas de indução adipogênica, houve redução da atividade proliferativa nas hASCs, as quais apresentaram uma parada do ciclo celular em G1. Os resultados obtidos sugerem que este processo é independente de DEPTOR (inibidor da via mTOR, a qual é conhecida por regular processos como proliferação), estando majoritariamente relacionado a uma redução na abundância de transcritos de ciclo celular e proliferação. Em uma segunda etapa do trabalho, foi avaliado o papel da DDX6 em hASCs. Observou-se que hASCs expressam DDX6, a qual se encontrou dispersa no citoplasma, também se concentrando em estruturas granulares, as quais tiveram um comportamento semelhante a P-bodies: a manutenção de sua estrutura depende de RNA, apresentam colocalização parcial com Dcp1a e aumentam de número após tratamento com um análogo de puromicina. Através da análise por gradiente de sacarose, observou-se que, em hASCs, DDX6 comigrou majoritariamente com a fração livre, mas foi também identificada na fração de monossomos/polissomos leves. Porém, quando foi feita indução para diferenciação, houve mudança no padrão de sedimentação. Através de análise por imunofluorescência e por coimunoprecipitação, observou-se que DDX6 associa-se a diferentes moléculas que regulam o ciclo de vida do RNAm em hASCs e têm seu padrão de distribuição alterado durante o início da adipogênese e da osteogênese, o que pode estar relacionado às mudanças no comportamento do ciclo celular e da regulação da expressão gênica observadas durante o início do processo de diferenciação. A análise complementar do conteúdo de RNAm que se associa aos complexos contendo DDX6 nestas diferentes condições poderá trazer mais informações sobre o possível papel desta helicase na regulação da expressão gênica durante o início da diferenciação em hASCs. Desta forma, os resultados obtidos podem auxiliar na compreensão de como a manutenção do estado indiferenciado de hASCs é regulada e dos mecanismos que ocorrem nas primeiras etapas da diferenciação adipogênica e osteogênica.
Resumen en ingles
Human adipose tissue-derived stem cells (hASCs) are known as an interesting source for regenerative medicine. The comprehension of how the balance between stemness and the differentiation process is controlled is an important step to better use and to take advantage of their potential. The regulation of the mRNA life cycle is one of the mechanisms that control this process, and it involves the acting of RNA-binding proteins, as the DDX6 helicase. In a Doctoral thesis developed in our group, we found that DDX6 knockdown (using RNAi) in hASCs led to the acceleration of the adipogenic differentiation, causing an increase in the lipid droplets accumulation. Therefore, the aim of this work was to analyze the gene expression regulation in hASCs after 24 hours of adipogenic and osteogenic differentiation and to study the role of DDX6 helicase in this process. First, we performed the sequencing of the total and the polysome-associated mRNA from hASCs non-induced or induced to adipogenesis and osteogenesis for 24 hours. In both differentiation processes, there was an important gene expression regulation. During osteogenesis most of the differentially expressed genes were upregulated, while in adipogenesis most of them were downregulated. After 24 hours of adipogenic induction, genes related to the differentiation process were already differentially expressed. This was not observed in osteogenesis, suggesting that the cell commitment with the differentiation process happens earlier in adipogenesis in hASCs. Moreover, after 24 hours of adipogenic induction, there was a decrease in the proliferative activity of hASCs, with G1-cell cycle arrest. The results obtained suggest that this process is DEPTORindependent (DEPTOR is an inhibitor the mTOR pathway, which regulates proliferation), and are mainly related to a reduction of the abundance of transcripts related to cell cycle and proliferation. Then, we evaluated the role of DDX6 in hASCs. We found that DDX6 is expressed in hASCs, mainly dispersed in the cytoplasm and also localized in granules. These granules had features of P-bodies: their structure was RNA-dependent, they colocalized partially with Dcp1a and there was an increased in their number and size after treatment with a puromycin analogue. Through sucrose gradient separation, we observed that, in hASCs, DDX6 comigrates mostly with the RNA-free fraction, but was also found in the monosome/light polysome fractions. However, when differentiation was induced, there was a change in the sedimentation pattern. Using immunofluorescence and coimmunoprecipitation, we also observed that, in hASCs, DDX6 is associated with molecules that regulate the mRNA life cycle. There was also a change in the distribution pattern of DDX6 after 24 hours of adipogenic and osteogenic induction that may be related to changes in the cell cycle and in the gene expression regulation during the beginning of the differentiation process. Further analysis of the mRNA content of the complexes associated to DDX6 in these different conditions may yield more information about a possible role of this helicase in the regulation of the gene expression during the beginning of the differentiation process of hASCs. The results obtained paved the way for a better understanding of the stemness maintenance and the processes involved in the early steps of the adipogenic and the osteogenic differentiation.
Palabras clave en portugues
Grânulos de RNPmPalabras clave en ingles
Stem CellsAdipose Tissue
Gene Expression Regulation
Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein Group M
RNA, Messenger
Palabras clave
Células MadreTejido Adiposo
Regulación de la Expresión Génica
Ribonucleoproteína Heterogénea-Nuclear Grupo M
ARN Mensajero
DeCS
Células-TroncoTecido Adiposo
Regulação da Expressão Gênica
Ribonucleoproteínas Nucleares Heterogêneas Grupo M
RNA Mensageiro
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