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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/43234
VACINA DE DNA CONTENDO O GENE NS1 DE DENGUE 2: RESPOSTA IMUNE CELULAR EM CAMUNDONGOS
Assis, Maysa Leandro de | Date Issued:
2020
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A febre da dengue é uma arbovirose pantropical que representa uma grande ameaça à saúde pública. A importância da resposta imune celular contra essa doença vem sendo cada vez mais ressaltada no desenvolvimento de vacinas, principalmente no que diz respeito à geração de respostas protetoras contra as proteínas não-estruturais do vírus. Nosso grupo vem há tempos desenvolvendo vacinas de DNA contra dengue com testes em modelos murinos. Uma destas vacinas é o plasmídeo pcTPANS1, baseada na proteína não-estrutural 1 (NS1) de dengue 2, que foi capaz de induzir altos níveis de proteção e títulos elevados de anticorpos. O presente trabalho teve como objetivo a identificação de peptídeos imunodominantes contidos na proteína NS1 reconhecidos por linfócitos T em camundongos BALB/c imunizados com a vacina pcTPANS1, bem como a investigação do papel desempenhado por essas células ativadas. Observamos que a vacina foi capaz de induzir respostas de células T com produção de IFN-\03B3 frente a uma biblioteca de peptídeos de NS1, através de ensaios de ELISPOT e de marcação intracelular de citocinas (ICS). Identificamos três peptídeos imunogênicos capazes de estimular a produção de IFN-\03B3 em camundongos vacinados com pcTPANS1 (N17, N46 e N67) e outros quatro peptídeos após desafio com DENV2 (N12, N14, N35 e N41), sendo o peptídeo N67 o mais imunodominante dentre estes. Além disso, avaliamos a produção de TNF-\03B1 e não observamos um aumento nas porcentagens de células produtoras desta citocina estimuladas com a maioria dos peptídeos da nossa biblioteca, com exceção dos peptídeos N67 e N17, este último somente após desafio com DENV2. Também procuramos identificar respostas de células T citotóxicas após estímulo com os peptídeos de maior significância estatística segundo nossos resultados (N14, N17, N35 e N67), através de ensaios de citotoxicidade in vivo Entretanto, não observamos diferenças nos percentuais de lise das células alvos pulsadas com estes peptídeos entre o grupo vacinado e não-vacinado. Selecionamos o peptídeo mais imunogênico (N67) para um ensaio comparativo com um peptídeo de 9 aminoácidos previamente descrito na literatura, AGPWHLGKL, cuja sequência está contida dentro do peptídeo N67. Observamos um percentual de lise de quase 100% nos camundongos vacinados que receberam os esplenócitos pulsados com este peptídeo, mas uma lise celular de apenas 32% quando pulsados com o peptídeo N67. Quando avaliamos a citotoxicidade por meio da marcação da molécula CD107a, não observamos diferenças significativas na quantidade de células expondo esse marcador após estímulo com tais peptídeos, apesar de ter sido notável um decréscimo na média de intensidade de fluorescência nas células advindas de animais imunizados. Por último, avaliamos a imunogenicidade dos nossos peptídeos em camundongos C57BL/6, de forma a considerar as diferenças oriundas da expressão de um haplótipo de MHC diferente ao do nosso modelo de estudo, e identificamos alguns peptídeos proeminentes na resposta de IFN-\03B3 em ambas as linhagens de camundongos. Para concluir, neste trabalho identificamos peptídeos importantes envolvidos na resposta celular direcionada contra a proteína NS1 de DENV2, ressaltando o papel desse braço da resposta imune na proteção contra dengue conferida pela vacina pcTPANS1.
Abstract
Dengue fever is a pantropical arthropod-borne viral disease whose growing incidence poses as a major threat in terms of public health. The importance of the cellular immune response against this disease has been increasingly highlighted in vaccine development, especially in regard to the generation of protective responses against the viral nonstructural proteins. Over the years, our group has been developing DNA vaccines against dengue and testing them in mouse models. One of these DNA vaccines is the plasmid pcTPANS1, based on the dengue 2 non-structural protein 1 (NS1), which was able to induce high levels of protection and generate high antibody titers. The aim of this work was the identification of immunodominant NS1-derived peptides recognized by T lymphocytes in BALB/c mice immunized with the pcTPANS1 vaccine, as well as the investigation of the role played by the aforementioned activated cells. Our vaccine was able to elicit T-cell responses with IFN-\03B3 production upon stimulation with a NS1 peptide library, as evaluated by ELISPOT and intracellular cytokine staining (ICS) assays. We identified three immunogenic NS1-derived peptides that were able to elicit IFN-\03B3 production in pcTPANS1-immunized mice (N17, N46 and N67) and four other peptides after DENV2 challenge (N12, N14, N35 and N41). Out of those peptides, peptide N67 was the most immunodominant one. Likewise, we evaluated production of TNF-\03B1 and we did not observe an increase in the percentage of T-cells producing this cytokine after stimulation with most of the selected peptides with the exception of peptides N67 and N17, the later only after virus challenge We also sought to identify T-cell cytotoxic responses upon incubation with the peptides of higher statistical significance according to our ELISPOT and ICS results (N14, N17, N35 and N67) by performing in vivo cytotoxicity assays. However, we observed no significant differences between the vaccinated and nonvaccinated groups in the percentage of lysis of cells pulsed with these peptides. We then selected the most immunogenic peptide N67 to perform a comparative assay alongside a 9mer peptide previously described elsewhere in the literature, AGPWHLGKL, whose sequence is contained inside peptide N67. We observed a percentage of almost 100% in cell lysis in vaccinated mice that received splenocytes pulsated with this peptide, whereas we obtained only a 32% cytotoxic percentage when those cells were pulsated with peptide N67. We also evaluated cytotoxicity by measuring CD107a expression, and although we did not observe any statistical difference after stimulation with such peptides, there was a remarkable decrease in mean fluorescence intensity in T-cells from pcTPANS1-immunized mice. Lastly, we assessed the immunogenicity of those peptides in C57BL/6 mice due to the difference in MHC haplotype expression comparing to our BALB/c mouse model and identified some NS1-derived epitopes that feature prominently in the IFN-\03B3 response in cells from both animal strains. To conclude, in this work we identified important peptides involved in the cellular response against the DENV2 NS1 protein, highlighting the role of this branch of the immune response in the protection elicited by our vaccine pcTPANS1 against dengue.
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