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EVOLUÇÃO IN VITRO DO VÍRUS ZIKA
Pessoa, Karina Pinheiro | Fecha del documento:
2019
Autor
Director
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisas Leônidas e Maria Deane. Manaus, AM, Brasil.
Resumen en portugues
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus da família Flaviviridae gênero Flavivirus com genoma composto por uma fita única de RNA de polaridade positiva. Assim como os demais vírus RNA, exibe variações em suas sequências, o que ocorre devido a fatores, como por exemplo, a falta de atividade de correção da polimerase viral e a alta taxa de replicação. Considerando que a ocorrência de mutações é um evento que pode levar a seleção de variantes virais com fitness alterado, este trabalho teve como objetivo avaliar a evolução in vitro do vírus Zika, analisando as mutações ocorridas durante o processo de adaptação em cultura células, associadas ao aumento ou diminuição da competência viral (viral fitness). Uma amostra positiva para ZIKV denominada 0305JFMB, foi isolada em células de Aedes albopictus C6/36, e utilizada para processo de adaptação em cultura de células C6/36, sendo realizadas 33 passagens em replicatas. Finalizadas as passagens, foi realizada a extração do RNA viral e o cDNA foi produzido utilizando iniciadores randômicos. O genoma completo da amostra 0305JFMB direto do plasma e das passagens P1, P33.1, P33.2, foi obtido pelo método Sanger utilizando sequenciador automático ABI 3130. Os dados do sequenciamento foram analisados utilizando o software Geneious, e mostrou que no decorrer das passagens ocorreram 7 mutações nas regiões que codificam para as proteínas não estruturais: uma mutação sinônima em NS1; uma mutação sinônima em NS2A; uma mutação sinônima em NS3; 4 mutações não sinônimas, duas na região que codifica para proteína NS3 e duas mutações na região que codifica para NS5. Para avaliar o impacto das mutações observadas sobre a competência viral, as passagens P1 e P33 foram tituladas através de um ensaio de RT-qPCR utilizando o método ΔΔCt, realizado em triplicatas técnicas. Posteriormente foram realizados os ensaios para avaliação da competência viral in vitro (C6/36) e in vivo (Aedes aegypti). Em C6/36 foi avaliado o número de cópias de RNA viral presente tanto no sobrenadante de células infectadas quanto no interior das células. Os resultados mostraram um aumento significativo do número de cópias de RNA viral nas células infectadas com P33 no período de 72 horas pós infecção. A carga viral avaliada nos tempos (8 e 12 dias) no experimento in vivo em Aedes aegypti em ambos os tempos a carga viral relativa de P33 foi inferior à de P1. Nossos resultados sugerem que novos estudos devem ser realizados para confirmar os impactos das mutações observadas em outros sistemas biológicos in vivo e in vitro, visto que as proteínas de ZIKV podem influenciar a forma que os componentes virais interagem com a célula hospedeira e, assim, podem modular sua infectividade em diferentes substratos celulares.
Resumen en ingles
The Zika virus (ZIKV) is an arbovirus of the family Flaviviridae genus Flavivirus with a genome composed of a single RNA strip of positive polarity. Like other RNA viruses, it exhibits variations in its sequences, which occurs due to factors such as the lack of viral polymerase correction activity and the high replication rate. Considering that the occurrence of mutations is an event that may lead to the selection of viral variants with altered fitness, this work aimed to evaluate the in vitro evolution of the Zika virus, analyzing the mutations occurred during the adaptation process in culture cells, associated with increased or decreased viral competence (viral fitness). A positive sample for ZIKV named 0305JFMB was isolated in Aedes albopictus C6/36 cells and used for adaptation in culture of C6 / 36 cells, with 33 passages in replicates. After completion of the passages, the viral RNA was extracted and the cDNA was produced using random primers. The complete genome of the 0305JFMB sample from the plasma and passages P1, P30.1, P30.2, P33.1, P33.2, was obtained by the Sanger method using ABI 3130 automatic sequencer. Sequencing data were analyzed using the Geneious software, and showed that during the passages 7 mutations occurred in the regions coding for -structural proteins: a synonymous mutation in NS1, a synonymous mutation in NS2A, a synonymous mutation in NS3 and in NS5 a non-synonymous. To evaluate the impact of observed mutations on viral competence, passages P1 and P33 were titrated through an RT-qPCR assay using the ΔΔCt method, performed in technical triplicates. Subsequently, the tests were carried out to evaluate in vitro viral competence (C6/36) and in vivo (Aedes aegypti). In C6/36 the number of copies of viral RNA present in both the supernatant of infected cells and inside the cells was evaluated. The results showed a significant increase in the number of copies of viral RNA in the cells infected with P33 within 72 hours post infection. The viral load evaluated at the times (8 and 12 days) in the in vivo experiment in Aedes aegypti at both times, the relative viral load of P33 was lower than that of P1. Our results suggest that further studies should be conducted to confirm the impacts of mutations observed in other biological systems in vivo and in vitro, since ZIKV proteins can influence the way that viral components interact with the host cell and can modulate its infectivity in different cell substrates.
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