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OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MOSQUITOS AEDES FLUVIATILIS TRANSGÊNICOS PARA O BLOQUEIO DA MALÁRIA AVIÁRIA
Rodrigues, Flávia Guimarães | Fecha del documento:
2007
Titulo alternativo
Attainment and molecular characterization of transgenics Aedes fluviatilis mosquitoes for the blockade of the avian malariaAfiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Resumen en portugues
A manipulação genética de mosquitos possibilita a inserção de moléculas efetoras que podem inibir o desenvolvimento de espécies de Plasmodium. O presente trabalho teve como objetivo estudar duas moléculas antiparasíticas [gomesina e fosfolipase A2 (PLA2m)] como candidatas à expressão em mosquitos. O peptídeo antimicrobiano gomesina da
aranha Acanthoscurria gomesiana, foi capaz de inibir o desenvolvimento das formas sanguíneas das cepas W2 e 3D7-GFP de P. falciparum, com valores de IC50 de 75,8 e 86,6µM, respectivamente. Além disso, mostramos que esta molécula na concentração foi capaz de reduzir em até 100% o desenvolvimento de oocinetos de P. berghei (a 50µM) e
oocistos de P. falciparum (a 100µM) Anteriormente, experimentos in vitro, mostraram que a enzima fosfolipase A2 (PLA2) isolada do veneno de abelha apresentou ação inibitória sobre o desenvolvimento de P. falciparum e P. gallinaceum, mas apresentou efeitos deletérios em
mosquitos transgênicos, quando na sua forma ativa. Neste trabalho, expressamos em bactérias e purificamos uma forma mutante da proteína (PLA2m). Na concentração de 0,1µmol/l a proteína recombinante foi capaz de reduzir em até 79% o número de oocistos de P. gallinaceum em mosquitos Aedes fluviatilis, quando adicionada ao sangue de aves
domésticas (Gallus gallus domesticus) infectadas. Para a geração de mosquitos transgênicos utilizamos o promotor da proteína 1 da matriz peritrófica de An. gambiae (AgPer1) para dirigir a expressão do gene da PLA2m. A construção do gene híbrido (AgPer1/PLA2m) foi inserida no elemento de transposição piggyBac, que contém como marcador, o gene da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP). Pela microinjeção de
770 embriões, foram formadas 15 famílias e, após a seleção de cerca de 22.000 larvas foram obtidas quatro linhagens transgênicas, representando uma eficiência na transformação de 27%. A expressão do EGFP foi observada no tubo neural e olhos de larva, pupa e adulto. Utilizando iniciadores específicos, confirmamos, pela PCR, a presença dos genes EGFP (700pb) e PLA2m (500bp). A produção do RNAm da PLA2m foi específica no intestino de fêmeas, não variando após a alimentação sanguínea. Por microscopia confocal detectamos a presença da proteína PLA2m no intestino dos mosquitos transgênicos. Além disso, ensaios de bloqueio ao parasita mostraram redução significativa do desenvolvimento de oocistos de P. gallinaceum, de 17,5 a 68,5%, nas quatro linhagens
transgênicas. Este estudo mostra a importância de moléculas efetoras e da geração de mosquitos transgênicos como estratégia alternativa de controle da malária, bem como, uma ferramenta para estudos de interação parasita/ vetor invertebrado.
Resumen en ingles
The genetic manipulation of mosquitoes allows the insertion of effector molecules to block the development of Plasmodium spp. This work aimed to study two antiparasitic molecules [gomesin and phospholipase A2 (mPLA2)] as candidates for expression in transgenic mosquitoes. Gomesin, an antimicrobial peptide from the Acanthoscurria gomesiana spider, was able to inhibit the growth of intraerythrocitic stages of both W2
and 3D7-GFP P. falciparum strains, at IC50 of 75.8 and 86.6µM, respectively. Furthermore, we showed that this molecule was able to reduce up to 100% the development of P. berghei ookinetes (at 50µM) and P. falciparum oocysts (at 100µM). Previously, in vitro experiments have shown that the bee venom phospholipase A2 (PLA2) inhibits both P. falciparum and P. gallinaceum oocyst development, although it
also presented deleterious effects to mosquitoes when expressed in transgenic anophelines, as an active enzyme. In this work, we expressed in bacteria and purified a mutant form of PLA2 (mPLA2). When mixed with P. gallinaceum infected blood, at 0,1µmol/l, the mPLA2 recombinant protein was able to reduce up to 79% the number of oocysts in Aedes fluviatilis mosquitoes. In order to generate transgenic mosquitoes we
used the Anopheles gambiae peritrophic matrix protein 1 promoter (AgPer1) to drive the mPLA2 expression. The hybrid gene construct (AgPer1/mPLA2) was inserted into the piggyBac transposable element which contains the green fluorescent protein gene (EGFP), as a marker. By injecting 770 Ae. fluviatilis embryos 15 families were formed and, after screening more than 22,000 larvae, we obtained four transgenic lines (27% of transformation efficiency). EGFP expression was observed on eyes and neural tubes of mosquito larvae, pupae and adult. Employing specific primers we confirmed, by PCR, the presence of the EGFP (700bp), as well as the mPLA2 (500bp) genes. The effector molecule (mPLA2) mRNA expression was specific to female midguts and was not
induced by a blood. By confocal microscopy we detected the presence of the mPLA2 protein only in transgenic mosquitoes´ midguts. Moreover, parasite blocking assays showed significant reduction on P. gallinaceum oocyst numbers (17.5 to 68.5%) in all four transgenic lines. This study shows the importance of parasite effector molecules and the generation of transgenic mosquitoes as an alternative malaria control strategy as well as a tool in studies of vector/parasite interactions.
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