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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/38982
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AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO PIROGÊNICA EM SOROS HIPERIMUNES E AMBIENTES SUJEITOS A VIGILÂNCIA SANITÁRIA: COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS IN VITRO E IN VIVO APLICADOS AO CONTROLE DA QUALIDADE
Pirogênio
Métodos Alternativos
Injetáveis
Ambiente
Vigilância Sanitária
Pyrogen
Alternative Methods
Injectable
Indoor Air
Health Surveillance
Silva, Cristiane Caldeira da | Data do documento:
2015
Autor(es)
Orientador
Coorientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
A necessidade de substituição do Teste de Pirogênio em Coelhos (RPT, sigla do inglês Rabbit Pyrogen Test) no controle da qualidade de produtos injetáveis torna urgente o estabelecimento de métodos alternativos que possam substituí-lo. Devido às limitações do Teste de Endotoxina Bacteriana ou Lisado de Amebócitos do Limulus (LAL), o Teste de Ativação de Monócitos (MAT, sigla do inglês Monocyte Activation Test) foi implementado na Farmacopéia Européia. Entretanto, o MAT foi considerado apenas como um terceiro teste devido à falta de estudos em relação a comparação in vivo e in vitro para alguns produtos como os biológicos, assim como para pirogênios não endotoxinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a aplicabilidade do MAT para soros hiperimunes e na resposta ao Zymosan comparando em paralelo com o modelo in vivo, assim como uma nova aplicação para ambientes comparando com a análise microbiológica. Desta forma, foram avaliados i. o uso do sangue criopreservado em relação ao fresco por doadores individuais e no pool tanto na contagem de diferentes tipos celulares, assim como na resposta de IL-1β em relação a Endotoxina, ii a aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) para 43 lotes de soros hiperimunes, assim como lotes contaminados artificialmente, através da determinação do limite de detecção (LD), da máxima diluição válida (MVD), do teste de interferentes, e da sensibilidade, especificidade e acurácia em relação ao RPT; iii aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) na detecção do Zymosan através da comparação em paralelo de amostras contaminadas artificialmente no RPT e no MAT, e iv aplicabilidade do MAT (IL-1β e Il-6) na detecção de pirogênios em amostras de ar em três laboratórios e dois escritórios, comparando com o método preconizado na legislação brasileira (contagem de fungos totais). Os resultados mostraram que a contagem de linfócitos/monócitos permaneceu estável durante o tempo de congelamento (-80ºC) e que o pool não interferiu na resposta a endotoxina. Além disso, o MAT apresentou alta sensibilidade (100%) e especificidade (87,5% para o Método A e 82,5% para o Método B), sendo mais sensível na detecção de soros hiperimunes do que o RPT. Os resultados do Zymosan seguiram a mesma tendência, onde o limite de febre encontrado no RPT foi de 5,000ng/mL e no MAT de 2,500ngmL-1. Este também foi capaz de detectar pirogênios em amostras de ar, variando entre 0,16 a 5,17 EUUmL-1 para IL-1β e de 0,49 a 5,70 EUUmL-1 para a IL-6 em estações frias e de 1,03 a 2,67 EUUmL-1 para IL-1β e de 1,10 a 2,67 EUUmL-1 para a IL-6 em estações quentes. Os resultados apresentados demonstraram que o MAT foi capaz de detectar e quantificar contaminações pirogênicas em soros hiperimunes, assim como pirogênios não endotoxina, podendo ser utilizado na rotina do controle da qualidade para estes produtos. Desta forma, os resultados deste estudo podem indicar a inclusão do MAT na Farmacopeia Brasileira para o controle da qualidade de soros hiperimunes, além de ser útil na tomada de decisão de órgãos internacionais em relação a substituição completa do RPT.
Resumo em Inglês
The need of replacement of animals in the Rabbit Pyrogen Test (RPT) for injectable product quality control becomes urgent the establishment of alternatives methods. Due to the limitation of Bacterian Endotoxin Test or Limulus Amoebocyte Lysate test (LAL), the Monocyte Activation Test (MAT) was implemented in the European Pharmacopoeia. However, the MAT was considered as a third test due the lack of studies related to in vivo and in vitro comparison for some products such biologicals, as well as, for non-endotoxin pyrogen. The aim of this study was to evaluate the applicability of MAT for hyperimmune sera and Zymosan contamination compared in parallel with the in vivo model, as well as, a new application for environment compared to the microbiological analysis. Thus, we evaluated i. the use of cryopreserved blood compared to fresh per individual donors and the pool, both in counting of different cell types, as well as, IL-1β response; ii. applicability of MAT (IL-1β and IL-6) on 43 batches of hyperimmune sera, as well as, contaminated batches artificially by determining the limit of detection (LD), maximal valid dilution (MVD), interfering test, and MAT sensitivity and specificity in relation to RPT; iii. applicability of MAT (IL-1β and IL-6) for detecting Zymosan by comparing artificially contaminated samples in parallel for RPT and MAT; iv. applicability (IL-1β and IL-6) for detecting pyrogens in air samples in three laboratories and two offices, compared with the method recommended in the Brazilian legislation (total counting of fungi). Results showed that the lymphocyte/monocytes count remained stable during freezing time (- 80°C) and the pool did not affect the response to endotoxin. In addition, MAT showed high sensitivity (100%) and specificity (87.5% for Method A and 82.5% for Method B) being more sensitive in the detection of hyperimmune sera than the RPT. Zymosan results followed the same tendency, where the fever limit found in RPT was 5.000 ngmL-1 and MAT was 2.500ngmL-1. The MAT was also able to detect pyrogens in air samples, ranging from 0.16 to 5.17 EUUmL-1 for IL-1β and from 0.49 to 5.70 EUUmL-1 for IL-6 in the cold season, and from 1.03 to 2.67 EUUmL-1 for IL-1β and from 1.10 to 2.67 EUUmL-1 for IL-6 in warm season. Results also showed that MAT was able to detect and quantify pyrogenic contamination in hyperimmune sera, as well as non-endotoxin pyrogens, and it can be used in routine quality control for these products. Thus, the results of this study may indicate the inclusion of MAT in the Brazilian Pharmacopoeia for hyperimmune quality control, in addition to international acceptance of MAT as a complete replacement of RPT.
Palavras-chave
Teste de Ativação de MonócitosPirogênio
Métodos Alternativos
Injetáveis
Ambiente
Vigilância Sanitária
Palavras-chave em inglês
Monocyte Activation TestPyrogen
Alternative Methods
Injectable
Indoor Air
Health Surveillance
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