Aplicação da citometria de fluxo no controle de qualidade de insumos e processos utilizados no desenvolvimento de kits para diagnóstico

Abstract

Ensaios baseados em microesferas tem sido alvo de inúmeros estudos na pesquisa básica e clínica, utilizando como metodologias tanto a citometria de fluxo como a plataforma de microarranjos líquidos. No entanto, ainda existe a necessidade de estudos que visem o desenvolvimento de metodologias de controle de qualidade de insumos e processos empregados nesses ensaios. Desta forma, a presente tese teve como objetivo principal desenvolver métodos aplicando a citometria de fluxo para avaliação de anticorpos ligados a fluorocromos e de processos de acoplamento de anticorpos e/ou antígenos a microesferas. A avaliação dos acoplamentos de anticorpos foi realizada através da citometria de fluxo tradicional e da citometria de fluxo quantitativa (CFQ). Conjugados anti-IgG-PE e anti-HBSAg-PE de diferentes fabricantes e lotes foram acoplados a microesferas e avaliados durante 18 meses. Os resultados mostraram que as melhores condições de acoplamento foram 5 µg/mL de anti-IgG-PE e 1:300 de anti-HBSAg-PE e que houve uma variação entre os lotes e fabricantes dos conjugados tanto na intensidade de fluorescência quanto na estabilidade. A CFQ se mostrou uma ferramenta fundamental para validação dos estudos de estabilidade. A avaliação dos acoplamentos de antígenos às microesferas foi tanto no citômetro de fluxo FACSCalibur quanto no equipamento LX200. Para tal, os diferentes antígenos foram acoplados às microesferas em distintas condições de acoplamento. Os resultados mostraram que a melhor condição de acoplamento foi 2 horas na presença de EDC/NHS. Além disso, todos os antígenos apresentaram uma queda significante da marcação durante os 18 meses de avaliação, sendo essa tendência de queda diferente entre as avaliações feitas nos equipamentos FACSCalibur e LX200. Comparando os resultados dos dois equipamentos, o LX200 apresentou resultados muito mais dispersos que o FACSCalibur. Desta forma, concluímos que a citometria de fluxo pode ser utilizada como uma importante ferramenta de controle de qualidade de insumos e processos utilizados em ensaios de microarranjos líquidos. Além disso, esse protocolo citofluorimétrico pode ser utilizado na avaliação e controle de qualidade de outros conjugados e processos utilizados em outras tecnologias.