Caracterização fenotípica de fungos isolados na rotina do controle microbiológico de Bio-Manguinhos/FIOCRUZ e estruturação de uma micoteca

Abstract

A indústria farmacêutica busca constantemente produzir e oferecer produtos com qualidade com o objetivo de garantir a eficácia do produto e a segurança do usuário. O regulamento que orienta as ações necessárias em todas as indústrias farmacêuticas do Brasil e trata das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos (BPF) é a RDC 17/2010. Segundo a Resolução, o monitoramento microbiológico de áreas controladas para produção de medicamentos deve ser realizado de modo que a contaminação ambiental seja evitada em todas as etapas de fabricação e, em caso de contaminação, que os micro-organismos isolados nesses ambientes sejam identificados, a fim de auxiliar a investigação da fonte de contaminação. A caracterização de fungos é extremamente importante para o conhecimento desta microbiota. Atualmente, a maioria dos métodos de identificação de micro-organismos utilizados nas indústrias farmacêuticas é baseada em provas bioquímicas (caracterização fenotípica), cujos sistemas são construídos com informações de isolados clínicos e não contemplam a diversidade ambiental. Não existem muitos relatos na literatura referentes aos contaminantes isolados em ambientes industriais. A identificação proteômica de micro-organismos por MALDI-TOF/MS apresenta-se inovadora por ser um método fácil, rápido, de alto rendimento e baixo custo. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente por bioquímica e proteômica as leveduras e morfologicamente e por proteôomica os fungos filamentosos isolados nas áreas produtivas de Bio-Manguinhos/Fiocruz e implementar os métodos na rotina de identificação de contaminantes do Laboratório de Controle Microbiológico. Os isolados foram obtidos a partir de amostras de monitoramento ambiental, monitoramento de água, validação e testes de esterilidade. As leveduras foram identificadas pelo sistema bioquímico VITEK 2 Compact (V2) e proteômico VITEK MS RUO (VMS) e os fungos filamentosos foram caracterizados pela morfologia e pelo sistema VMS. Entre fevereiro de 2012 e novembro de 2013 foram isolados 514 fungos, sendo 453 (88%) fungos filamentosos e 61 (12%) leveduras. O sistema VMS apresentou melhor desempenho na identificação das leveduras de referência em comparação com o sistema V2. Na identificação dos isolados de leveduras autóctones, o sistema V2 apresentou maior número de identificações, em comparação com o sistema VMS, porém esse último teve maior diversidade de gêneros identificados. O gênero Candida foi o mais frequentemente identificado em ambas as metodologias. Os gêneros de fungos filamentosos identificados pela morfologia totalizaram 11, sendo Aspergillus o gênero encontrado com maior frequência (30% dos isolados), seguido pelos gêneros Penicillium (27%) e Cladosporium (23%). Foram selecionados 10 isolados autóctones da espécie A. versicolor para análise pelo VMS, juntamente com a cepa de referência A. versicolor INCQS 40028 (ATCC 16853), com tempo de crescimento de dois, três, quatro, cinco, seis e sete dias de incubação. Foi realizada a análise do BD/SARAMIS (BD) para todas leveduras que foram previamente identificados pela bioquímica e todos os fungos filamentosos previamente identificados pela morfologia. Com base nos resultados, constata-se a importância de inserir no BD os representantes fúngicos que não fazem parte deste banco, assim como os isolados não identificados, para ampliar a performance de identificação de espécies fúngicas. A implementação da metodologia de identificação morfológica dos fungos filamentosos em nível de gênero na rotina do laboratório foi concluída com êxito.