Estudos sobre a função da subunidade α4 de integrina em células T: inativação gênica e inserção de polimorfismos de nucleotídeo único no gene ITGA4

Abstract

As integrinas são a principal família de proteínas de superfície celular mediadoras de interações intercelulares e com a matriz extracelular (ECM). Com isso, elas desempenham funções em processos celulares distintos, como a diferenciação, proliferação, morte e resposta imune. Além disso, variações nas regiões reguladoras e nas sequências gênicas parecem estar relacionadas com mudanças nos níveis de expressão das integrinas. Nesse sentido, estudos sobre os polimorfismos de base única (SNPs; do inglês, single nucleotide polymorphisms) são considerados centrais para o entendimento de doenças inflamatórias e autoimunes relacionadas a essas proteínas. Visando estudar o papel da integrina \03B14 na biologia dos linfócitos T, definimos duas estratégia experimentais: i) gerar por CRISPR/Cas9 uma linhagem de células Jurkat deficiente geneticamente em ITGA4 (ITGA4-KO); ii) identificação de SNPs do gene ITGA4 e análise in silico do impacto da inserção desses SNPs sobre a relação estrutura-função da integrina VLA-4.Surpreendentemente, a caracterização inicial por sequenciamento massivo de RNA (RNA-Seq) revelou que a ausência da integrina \03B14 modula 443 genes associados à morte celular. Dessa forma, buscando compreender o papel dessa integrina e de suas variantes na regulação de processos celulares e mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência celular, decidimos investigar o impacto da ausência da integrina \03B14 na linhagem deficiente em ITGA4 em condições de estresse por privação de soro. Nossos achados indicam que as células mutantes parecem ser mais suscetíveis à ausência de nutrientes. Em comparação às células selvagens, a linhagem ITGA4-KO apresentou uma frequência de apoptose inicial duas vezes maior após 48 horas sem soro fetal bovino no meio de cultura Contudo, nós observamos um aumento do número de vacúolos nas células mutantes para ITGA4 em relação às células selvagens após 48 horas de privação de nutrientes, o que sugere autofagia. Provavelmente, o mecanismo pelo o qual a subunidade \03B14 modula a sobrevivência celular está relacionado à sua interação com outras proteínas. Por sua vez, com o intuito de avaliar a relevância das interações estruturais da subunidade \03B14 de integrinas, nós analisamos variantes de nucleotídeo único em substituição à sequência referência. Nossos achados preliminares por bioinformática revelaram a existência de um total de 21.506 SNPs no gene ITGA4 em Homo sapiens. Entre os SNPs não-sinônimos, identificamos duas substituições, rs35322532 (R1007S) e rs13029893 (S634T), possivelmente deletérias. Em seguida, realizamos docking molecular das subunidades \03B14, sem alterações ou contendo as variações R1007S e S634T, contra as três principais proteínas que interage, fibronectina, VCAM-1 e paxilina. A variante R1007S obteve os melhores parâmetros de encaixe com a paxilina, enquanto a variante S634T teve o resultado mais favorável contra o segmento IIICS da fibronectina. Os polimorfismos em diferentes porções da subunidade \03B14 parecem produzir um aumento de afinidade aos seus ligantes naturais. Em conjunto, nossos estudos apontam para a possível relevância da integrina VLA-4 na sobrevivência de células T, assim como para o impacto de SNPs específicos na relação estrutura-função dessa integrina, com potencial efeito sobre o papel funcional de células T em condições fisiológicas e patológicas.