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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35343
PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE AMASTIGOTAS DE LEISHMANIA INFANTUM
Imunidade Celular
Antígenos recombinantes
Leishmania infantum
Animais
Cães
Cellular immunity
Recombinant antigens
Leishmania infantum
Animals
Dogs
Teixeira, Márcia Cristina Aquino | Date Issued:
2004
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
O programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil, através da
eliminação de cães infectados com Leishmania, não produziu resultados satisfatórios. Além da baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos empregados e a demora entre a detecção e a eliminação de cães soropositivos, este tipo de medida enfrenta a pouca aceitação por médicos
veterinários e donos dos cães. Apesar do encontro de cães na área endêmica com perfil dc resistência à infecção por Leishmania, sugerindo que uma vacina é possível, ate o presente momento não estão disponíveis vacinas humanas ou para uso veterinário, com eficácia comprovada. Este estudo teve como objetivo a padronização ou desenvolvimento de
metodologias para a obtenção e avaliação de proteínas recombinantes de amastigotas de Leishmania infantun/chagasi, potencialmente candidatas a componentes de ensaios sorológicos para diagnóstico da LV humana e/ou canina ou de uma vacina para cães contra a infecção por L. Infantun/chagasi. Inicialmente foi estabelecida a melhor condição de cultivo
axênico para obtenção de amasligotas extracelulares de três espécies distintas de Leishmania. Apesar de morfologicamente semelhantes às formas amastigotas intracelulares, as formas axênicas de L. infantum/chagasi não apresentaram homogeneidade quanto à viabilidade e
infectividade, contrastando com o observado com as espécies L. braziliensis e L. amazonensis. Dessa forma, amastigotas purificados de baço de hamsters infectados foram utilizados para purificação do RNA e produção de uma biblioteca de cDNA de L. infantun/chagasi. Cinco antígenos recombinantes diferentes foram selecionados da biblioteca
de cDNA utilizando uma mistura de soros de cães ou de pacientes com leishmaniose visceral. Os soros dos indivíduos infectados não reativos a esses antígenos foram utilizados para identificar novos clones recombinantes, constituindo uma nova abordagem para obtenção de
antígenos com potencial de aumentar a especificidade de um ensaio imunodiagnóstico. A adição dos novos antígenos elevou significativamente a sensibilidade de um ensaio “dipstick” utilizado para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em relação a um painel limitado de soros. Além da utilização de anticorpos produzidos na infecção natural à Leishmania, foram testados também protocolos de imunização de três espécies diferentes de animais para a obtenção de anticorpos reativos aos antígenos da biblioteca, potencialmente úteis na seleção ou em processos de purificação das proteínas recombinantes. Os anticorpos produzidos
durante a infecção subclínica foram capazes de reconhecer indistintamente proteínas de promastigotas e de amastigotas, apresentando, entretanto, maior reatividade com as formas evolutivas intracelulares, sugerindo que a imunização através da infecção com promastigotas vivos é mais eficiente na indução da produção de anticorpos contra ambos estágios de vida da
Leishmania do que a injeção de lisados de promastigotas. A infecção subclínica em cães também induziu eficazmente resposta imune celular contra antígenos totais e recombinantes de L. infantun/chagasi, como determinado pelos ensaios de linfoproliferação e teste de hipersensibilidade tardia. O protocolo de imunização com cães, testado neste trabalho, pode ser bastante útil na seleção e/ou com ensaios imunobiológicos de antígenos de Leishmania promissores para o desenvolvimento de vacinas e/ou métodos imunoterápicos.
Abstract
The control prograinme for visceral leishmaniosis (VL) in Brazil, Ihrough the culling ol'Lcishnianici-iniecied dogs has not produced satisfactory results. Besides the low sensitivity of the diagnostic methods applied and the delay between detection and culling of seropositive dogs, this type of measure faces a low acceptance by veterinarians and dog owners. Despite the existence of dogs at the endemic area with a Leishmania infection- rcsistant profile, suggesting that the development of a vaccinc is feasible, human- or vclerinary-use vaccines with proved eltlcacy arc not yet available. This study had as its objective the standardization or development of methodologies for obtaining and evaluating rccombinanl proteins of Lcishmunia injaulumlchagasi amastigotes, potential candidates to become components of serological assays for the immunodiagnosis of human and/or canine VL, or of a vaccine for dogs against infection by L. iufaiUiuu/chagasi. Initially, the best condition for the axenic cultivation for obtaining extra-cellular amastigotes of three distinct species of Leishmania was established. Despite being moiphologically similar to the intracellular amastigote forms, the axenic forms of L. infantum/chagasi were not homogeneous regarding their viability and infectivity, contrasting with that observed with the species L. braziHensis and L. unutzonensis. In this way, purified amastigotes from the spleen of infected hamsters were used for the purification of IlNA and the production of a L. infantum!chagasi cDNA library. Five diffcrenl recombinant antigens were selected from the cDNA library through the use of a mixture of dogs’ or patients’ sera with visceral leishmaniosis. Human sera which are not reactive with these antigens were used to identify new recombinant clones, constituting a new approach for obtaining antigens with potential to increase the specificity of an immunodiagnostic assay. The addition of new antigens increased significantly the sensitivity of a dipstick assay used for the diagnosis of human visceral leishmaniosis, in relation to a limited panncl of sera. In addition to the use of antibodies produced during the natural infection by Leishmania, piotocols of immunization in three different species of animals were tested, in ortier to obtain antibodies reacting with antigens from the library, potentially useful in the selection or in purillcation processes of recombinant proteins. The antibodies produced during a sub-clinical infection were capable of indistinctively lecognizing proteins of promastigotes and amastigotes, showing, however, a higher reactivity with the intra-cellular evolutive forms. This suggests that the immunization through infection with live promastigotes is more ef ficient in inducing the production of antibodies against both life stages o\' l.cishmania than the injection of promastigote lysates. 7’he sub-clinical infection in dogs has also efficiently induced a cellular immune response against total and recombinant A. injiijiliim/cliagasi antigens, as tletermined through a lymphoproliferative assay and delayed hypersensitivity test. The immunization protocol in dogs, tested in this work, can be very useful in the selection and/or in immuno-biological assays of promising Leishmania antigens for the development of vaccines and/or immunotherapeutic methods.
Keywords in Portuguese
Leismaniose visceralImunidade Celular
Antígenos recombinantes
Leishmania infantum
Animais
Cães
Keywords
Visceral leishmaniosisCellular immunity
Recombinant antigens
Leishmania infantum
Animals
Dogs
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