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ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE INATA CELULAR IN VITRO CONTRA DENGUE VIRUS E ZIKA VIRUS
Pessoa, Natália Lima | Fecha del documento:
2017
Autor
Director
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Resumen en portugues
Dengue virus (DENV) e Zika virus (ZIKV) pertencem ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae. São arbovirus transmitidos por mosquitos do gênero Aedes, porém, outros modos de transmissão vêm sendo relatados para ZIKV, como a transmissão vertical e sexual. DENV possui quatro sorotipos distintos (DENV 1 - 4), cada um com vários genótipos e todos são capazes de causar a dengue não grave, com e sem sinais de alarme, e a dengue grave. O ZIKV possui duas linhagens, a asiática e a africana. Já foi comprovado que a infecção tanto por DENV como por ZIKV podem causar complicações neurológicas graves. E, recentemente, ZIKV vem sendo relacionado com microcefalia e Síndrome de Guillain-Barre. Como somos um país endêmico para Flavivirus, o primeiro passo do trabalho foi comprovar que as amostras de ZIKV recebidas por nossa instituição eram realmente este vírus, e não havia coinfecção com DENV. Para isto, foi feita PCR em tempo real com iniciadores específicos para ZIKV e DENV e também nested PCR com iniciadores para DENV, demonstrando que o ZIKV foi positivo na PCR em tempo real e foi negativo para DENV pelo nested PCR. O objetivo principal desta dissertação foi comparar a resposta imune celular desencadeada por dois isolados distintos de DENV 3, um neurotrópico (genótipo I) e outro não neurotrópico (genótipo III). E também comparar a resposta imune desencadeada por dois isolados brasileiros de ZIKV (PE243 e SPH). O estudo a resposta imune desencadeada pelos vírus foi feito através da quantificação da produção de óxido nítrico e de diferentes citocinas, avaliando a susceptibilidade à infecção e multiplicação viral das diferentes células utilizadas neste trabalho e avaliando a ativação de TLR2 e/ou TLR4. Assim, macrófagos intraperitoneais de camundongos C57BL/6, células KG-1 e THP-1 foram infectadas com DENV e ZIKV, e os sobrenadantes destas células foram coletados em diferentes dias após a infecção. Os sobrenadantes foram analisados por reação de Griess, para a quantificação do óxido nítrico produzido pelas células e por CBA para a quantificação das citocinas. Também foi avaliado se estas células foram susceptíveis à infecção dos vírus, por titulação. Nas células KG-1, foi detectado DENV 3 genótipo I até o 10° d.p.i. e ZIKV até o 5º d.p.i., com títulos mais altos em comparação com os macrófagos murinos. Não foi detectado DENV 3 genótipo III nas células KG-1. Como só foram detectados virus nos 1º e 2º d.p.i. nos macrófagos intraperitoneais de camundongo, é possível sugerir que os vírus foram inibidos pela capacidade destas células de produzir uma resposta imune inata eficaz contra a infecção por DENV e por ZIKV. Foi demonstrado que o NO e o IFNγ são importantes no controle da infecção por DENV 3. E que as citocinas TNF, IL-6 e a quimiocina MCP-1 estão relacionadas à infecção pelo sorotipo neurovirulento. E ainda, a ativação de TLR2 também é maior quando as células são infectadas pelo genótipo neurovirulento. Portanto, a resposta imune desencadeada pelo genótipo neurovirulento foi diferente em comparação com a resposta imune desencadeada pelo genótipo não neurovirulento. Também foi demonstrado que os dois isolados de ZIKV utilizados desencadeiam respostas imunes completamente diferentes, sendo que a amostra ZIKV PE243 desencadeou uma resposta imune mais forte, com produção de NO, maior produção das citocinas e ativação de TLR2 enquanto que a resposta imune desencadeada por ZIKV SPH foi mais branda, sem produção de NO, com menor produção de citocinas e sem a ativação de TLR2.
Resumen en ingles
Dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) belong to the genus Flavivirus of the family Flaviviridae. They are arboviruses transmitted by mosquitoes of the genus Aedes, however, other routes of transmission have been reported for ZIKV, such as vertical and sexual transmission. DENV has four distinct serotypes (DENV 1-4), each with several genotypes and all can cause non-severe dengue, with and without warning signals, and severe dengue. The ZIKV has two lineages, the Asian and the African. It has been proven that infection by both DENV and ZIKV can cause severe neurological complications. And recently, ZIKV has been linked to microcephaly and Guillain-Barre Syndrome. As we are an endemic country for Flavivirus, the first step of the work was to prove that the ZIKV samples received by our research center were really this virus, and there was no coinfection with DENV. For this, PCR was done in real time with specific primers for ZIKV and DENV and nested PCR with primers for DENV, demonstrating that the ZIKV was positive in the PCR in real time and was negative for DENV by the nested PCR. The main objective of this dissertation was to compare the cellular immune response triggered by two distinct isolates of DENV 3, one neurotropic (genotype I) and one non-neurotropic (genotype III). We also compare the immune response triggered by two Brazilian isolates of ZIKV (PE243 and SPH). The study of the immune response triggered by the virus was done by quantifying the production of nitric oxide and different cytokines, evaluating the susceptibility to infection and viral multiplication of the different cells used in this study and evaluating the activation of TLR2 and / or TLR4. Thus, intraperitoneal macrophages of C57BL / 6 mice, KG-1 and THP-1 cells were infected with DENV and ZIKV, and supernatants from these cells were collected on different days after infection. The supernatants were analyzed by Griess reaction, for quantification of the nitric oxide produced by the cells and by CBA for the quantification of the cytokines. It was also evaluated whether these cells were susceptible to virus infection by titration. In KG-1 cells, DENV 3 genotype I was detected up to 10º d.p.i. and ZIKV up to the 5º d.p.i., with higher titres compared to murine macrophages. No DENV 3 genotype III was detected in KG-1 cells. As only viruses were detected in the 1st and 2nd d.p.i. in mouse intraperitoneal macrophages, it is possible to suggest that viruses were inhibited by the ability of these cells to produce an innate immune response against infection by DENV and ZIKV. It has been shown that NO and IFNγ are important in the control of DENV 3 infection. And that the cytokines TNF, IL-6 and chemokine MCP-1 are related to infection by the neurovirulent serotype. Also, TLR2 activation is also enhanced when cells are infected by the neurovirulent genotype. Therefore, the immune response triggered by the neurovirulent genotype was different compared to the immune response elicited by the non-neurovirulent genotype. It has also been shown that the two ZIKV isolates used trigger completely different immune responses, and the ZIKV PE243 sample elicited a stronger immune response with NO production, increased cytokine production and activation of TLR2 whereas the immune response triggered by ZIKV SPH was milder, without NO production, with less production of cytokines and without the activation of TLR2.
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