O efeito do silenciamento gênico de Pumilio na pluripotência e cardiomiogênese de células-tronco embrionárias humanas

Abstract

A regulação pós transcricional em células-tronco embrionárias (ESC) desempenha um papel fundamental em diferentes processos biológicos. Diversos trabalhos demonstram que múltiplos mRNAs são co-regulados por uma ou mais proteínas de ligação a RNA (RBPs) que orquestram sua expressão. As proteínas PUF formam uma família de RBPs evolutivamente conservadas e as proteínas Pumilio (membros dessa família) têm sido associadas com a manutenção do estado indiferenciado de células germinativas. Em humanos, são encontrados dois homólogos dessa família: PUM1 e PUM2. Em estudos com hESC, PUM2 parece estar associada ao estado indiferenciado dessas células, sendo mais expressa em relação a PUM1. Para buscar entender o papel destas duas proteínas em hESC, esse trabalho teve como objetivo o silenciamento gênico de PUM1 e PUM2 em hESC, tanto na forma indiferenciada quanto durante a diferenciação cardiomiogênica, utilizando o sistema lentiviral. A expressão de PUM1 e PUM2 foi analisada ao longo do processo de cardiomiogênese. Ambos mRNAs apresentam um aumento da sua expressão em nível de RNA total ao longo da diferenciação. Após estas análises, a estratégia de silenciamento gênico foi empregada. Os lentivírus utilizados como ferramenta no processo de silenciamento foram produzidos em células HEK293FT, contendo o vetor pLKO-1. Esse vetor contém sequências de shRNA que reconhecem o mRNA de PUM1 ou PUM2. As hESC foram silenciadas utilizando os vetores lentivirais na diluição determinada na titulação, e, após 24 horas de transdução, RNA e proteínas foram extraídos para análise dos efeitos do silenciamento de PUMILIO em hESC. O silenciamento foi confirmado pela análise da expressão de PUM1 e PUM2 por qPCR. Foi observado também por qPCR que genes relacionados a pluripotência; OCT4 e NANOG, sofreram uma diminuição nos seus níveis de mRNA. Para análise dos efeitos do silenciamento durante cardiomiogênese, RNA foi extraído de 3 pontos ao longo do processo de diferenciação (dias 1, 4 e 9). O silenciamento de PUMILIO não se manteve ao longo do processo de diferenciação, porém a eficiência de diferenciação aumentou nas células silenciadas. Esse resultado indica que PUMILIO pode ter um papel no início da diferenciação, até mesmo na manutenção da pluripotência. Alvos de Pumilio podem estar livres no citoplasma ou associados à polissomos, indicando que estão sendo traduzidos. A análise de ontologia gênica dos mRNAs nestas duas frações poderia sugerir quais estão participando do processo de diferenciação. NFIA (Nuclear Factor I A), um gene que codifica um fator de transcrição descrito como regulador da via Notch, participando no desenvolvimento de mesoderme e linhagem cardíaca, é um alvo de PUMILIO. NFIA mostou-se aumentado durante a diferenciação cardiomiogênica. Os dados obtidos nesse trabalho sugerem que PUMILIO participe da regulação da pluripotência e cardiomiogênese de hESC.