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ABORDAGENS DE GENÉTICA MOLECULAR APLICADAS AO ESTUDO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA EM ÁREAS DE CIRCULAÇÃO DE PARASITAS CONTENDO O ENDOSSIMBIONTE VIRAL LRV1
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Resumo
A leishmaniose tegumentar (LT) é uma infecção de amplo espectro clínico, com manifestações que podem apresentar desde um envolvimento cutâneo (LC) até as formas mais graves da doença, com comprometimento das mucosas (LM). Os fatores que predispõem a evolução clínica têm natureza multifatorial e não estão totalmente esclarecidos. O presente trabalho incluiu a análise de 734 amostras de pacientes, todos do Estado de Rondônia, com suspeita clínica de LT e buscou avaliar diferentes fatores que podem contribuir com a progressão da doença, sendo estes: i) a espécie do parasita, por PCR/RFLP, ii) a presença de um vírus RNA1 no interior de parasitas Leishmania (LRV1), por RT-PCR e, iii) a análise da expressão de 96 genes relacionados resposta imune frente a infecção por Leishmania e de genes de virulência do parasita, por Fluidigm. Foram avaliados também a relação de sensibilidade entre testes moleculares (PCR kDNA e hsp70) e o parasitológico direto em amostras clínicas. Considerando a importância do LRV1 na epidemiologia da LT na região onde realizamos este estudo, foram conduzidas análises filogenéticas do LRV1 em isolados de Leishmania por análise das sequências do vírus Os resultados de 557 amostras positivas para LT demostram que L. braziliensis é o principal agente etiológico de LT em Rondônia (84,79%) e que o perfil de pacientes acometidos é similar ao encontrado em outras regiões, com maior índice de infecção em homens (78,6%), com idade entre 20 e 60 anos, e, que o LRV1 tem uma frequência de 36,2% (N=198), sendo detectado em quatro espécies: L. braziliensis, L. guyanensis, L. lainsoni e L. shawi. Foram identificados genes humanos com expressão aumentada, com destaque para os genes NLRP3, CASP1, IL12, IL21, demonstrando uma efetiva resposta imune pela baixa carga parasitária observada nos pacientes que apresentaram maior expressão desses genes, ao mesmo tempo que foi observado também um aumento da expressão de genes de virulência de Leishmania (TRYR, PRX, MAPK, GSH e GP63). Os testes parasitológicos aplicados demonstraram elevada sensibilidade do PCR kDNA (94,8%), seguido do PCR hsp70 (77,7%) e uma menor sensibilidade do parasitológico direto (63,8%). As análises filogenéticas mostraram que as sequências LRV1 são agrupadas de acordo com as espécies parasitas reforçando a hipótese de co-evolução Leishmania/LRV1.
Resumo em Inglês
Tegumentary leishmaniasis (LT) is an infection of a broad clinical spectrum, with manifestations that may present from a cutaneous involvement (CL) to more severe forms of the disease, with mucosal involvement (ML). The factors predisposing to clinical evolution are multifactorial in nature and are not fully understood. The present study was conducted at the State of Rondonia, West Amazonian Region in Brazil, and analysed 734 samples from patients with clinical suspicion of LT. The aim was to evaluate several factors that would contribute to the disease progression, as follow: i) parasite species, by PCR / RFLP, ii) presence of a RNA1 virus (LRV1), by RT-PCR and, iii) gene expression (n= 96), using Fluidigm expression assay, of genes related to the immune response to Leishmania infection, as well as, gene expression of some parasite genes. In addition, it was also investigated the comparative sensitivity between molecular tests (kDNA and hsp70 PCR) and parasitological direct investigation in clinical samples. Considering the relevance of LRV1 in the LT\2019 epidemiology in the studied region, phylogenetic analysis were conducted by analysing the virus RNA sequences The results of 557 positive samples for TL show that L. braziliensis is the main etiological agent of TL in Rondonia (84.79%) and that the profile of patients affected is similar to that found in other regions, with a higher infection rate in men (78.6%), with age between 20 and 60 years. LRV1 has a frequency of 36.2% (N = 198), being detected in four species: L. braziliensis, L. guyanensis, L. lainsoni and L. shawi. Human genes with increased expression were identified, highlighting the genes NLRP3, CASP1, IL12, IL21, demonstrating an effective immunological as this was correlated with lower parasite load. It was also observed an increasing in expression of Leishmania genes (TRYR, PRX, MAPK, GSH and GP63). The parasitological tests applied showed high kDNA PCR sensitivity (94.8%), followed by hsp70 PCR (77.7%) and a lower parasitological test sensitivity (63.8%). Phylogenetic analyzes showed an association between LRV1 sequences clusters and Leishmania species, reinforcing a coevolutionary hypothesis of Leishmania / LRV1.
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