Resposta imune gerada com vacinas de DNA codificando diferentes domínios da proteína E de dengue 2, associada ou não à proteína NS1

Abstract

A dengue representa um problema de saúde pública mundial. O agente etiológico desta enfermidade é o vírus da dengue (DENV) que compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos: DENV1-4. A proteína do envelope (E) é o principal alvo de anticorpos neutralizantes (AcN). Entretanto, ainda não se sabe exatamente quais domínios dessa proteína contribuem mais eficientemente na produção desses anticorpos. Nosso grupo desenvolveu várias vacinas de DNA contra dengue, incluindo o plasmídeo pE1D2, que possui a sequência que codifica o ectodomínio (domínios I, II e III) da proteína E de DENV2. Esta vacina induziu uma resposta imune protetora contra DENV2 em camundongos BALB/c. A proteína não estrutural 1 (NS1) também é apontada como possível antígeno protetor contra DENV. Nosso grupo construiu a vacina de DNA pcTPANS1 que também se mostrou bastante protetora. Baseado nestes dados, construímos um plasmídeo, pNS1/E/D2, que contém os genes que codificam ambas proteínas, NS1 e E, sob o controle de promotores distintos. Assim, este trabalho tem como objetivos caracterizar a resposta imune humoral e celular gerada pela vacina de DNA pE1D2 e estudar a vacina pNS1/E/D2 em ensaios in vitro e in vivo. Inicialmente, os anticorpos anti-DIII (domínio III da proteína E) foram depletado do soro de camundongos imunizados com pE1D2. Os níveis de AcN foram avaliados por ensaios de redução de plaque e os anticorpos direcionados contra epítopos contidos nos DI/II foram mais neutralizantes do que os que reconhecem o DIII. Além disso, anticorpos anti-DIII interferiram negativamente na neutralização mediada pelos anticorpos anti-DI/II Em paralelo, foi construída uma nova vacina de DNA (pE3D2) contendo apenas a sequência que codifica os domínios I e II da proteína E. Tal plasmídeo gerou proteção parcial em ensaios in vivo de imunização e desafio com DENV2. Posteriormente, a resposta imune celular induzida com pE1D2 foi avaliada através de ELISPOT frente ao estímulo com uma biblioteca de peptídeos contida na proteína E. Cinco peptídeos foram identificados como potenciais epítopos antigênicos envolvidos na resposta imune mediada por pE1D2 e mais dois também se mostraram imunogênicos após o desafio com DENV2. Em relação à vacina pNS1/E/D2, a análise por imunofluorescência de células transfectadas com clones deste plasmídeo revelou que a expressão de NS1 foi inferior à expressão da proteína E. Tais resultados se refletiram também na análise da resposta imune. O ensaio de ELISA revelou níveis mais elevados de anticorpos anti-E do que anti-NS1 nos animais imunizados com o pNS1/E/D2 quando comparados aos controles. Além disso, a análise da resposta imune celular através de ELISPOT demonstrou que os esplenócitos de animais imunizados com pNS1/E/D2 foram reativos a peptídeos sintéticos presentes nas proteínas E e NS1. Porém, a ativação celular mediante estímulo com peptídeo contido na proteína NS1 foi maior nos animais que receberam a vacina pcTPANS1. Em ensaios de imunização e desafio com DENV2, o plasmídeo pNS1/E/D2 se mostrou bastante protetor, uma vez que os camundongos imunizados não apresentaram sinais clínicos da infecção. Como conclusão, observamos que a combinação com os plasmídeos pE1D2 e pcTPANS1 foi mais protetora que os plasmídeos isolados e os anticorpos gerados contra os domínios I e II foram mais neutralizantes.