Genética reversa de arbovírus: chikungunya, febre amarela e dengue

Abstract

Epidemias e endemias causadas pelos vírus chikungunya (Chikungunya virus, CHIKV), febre amarela (Yellow fever virus, YFV) e dengue (Dengue virus, DENV) têm resultado em elevadas taxas de morbidade e mortalidade, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Atualmente, não há fármacos licenciados contra CHIKV, YFV e DENV e as vacinas aprovadas contra YFV e DENV são restritas quanto à distribuição e público-alvo. Nesse contexto, plataformas de genética reversa viral têm sido demandadas principalmente para o desenvolvimento de vacinas e avaliação em larga escala de compostos antivirais. Os sistemas de genética reversa disponíveis para CHIKV e YFV, no entanto, usam protocolos onerosos e laboriosos de clonagem em Escherichia coli. Em adição, genomas de alguns flavivírus, a exemplo do DENV, frequentemente apresentam considerável instabilidade quando mantidos em bactérias. Para contornar esses vieses, o presente trabalho objetivou a construção e caracterização de sistemas de genética reversa por recombinação homóloga em levedura para CHIKV, YFV e DENV. O sistema de genética reversa para CHIKV gerou o vírus recombinante IC-CHIKV-99659 e também foi usado para o desenvolvimento da linhagem celular BHK-21-GLuc-nsP-CHIKV-99659, essa expressando o gene repórter da Gaussia luciferase (GLuc) sob o comando do subgenoma do CHIKV-99659. O IC-CHIKV-99659 se mostrou infectivo e replicativo e a linhagem BHK-21-GLuc-nsP-CHIKV-99659 apresentouse estável para a expressão dos genes heterólogos. Em relação à genética reversa para YFV e DENV, os vírus YFV-GLuc e pSVJS01-DENV2, previamente obtidos por recombinação homóloga em levedura, foram caracterizados genetica- e fenotipicamente. O YFV-GLuc conservou o gene GLuc íntegro ao longo de seis passagens e apresentou cinética de replicação correlacionada à expressão do gene repórter. O pSVJS01-DENV2 apresentou cinética de replicação semelhantes ao vírus parental e ausência de mutação na região do envelope. Assim, ao desenvolver e caracterizar sistemas estáveis de genética reversa em levedura para CHIKV, YFV e DENV, o presente trabalho fornece uma plataforma alternativa à desenvolvida em bactéria para a manipulação de diferentes genomas virais.