Avaliação de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da hepatite B utilizando amostras de soro e fluido oral

Abstract

INTRODUÇÃO: A detecção e/ou quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) é útil para caracterizar a infecção, definir o início do tratamento antiviral, monitorar o curso clínico da infecção e demonstrar o efeito dos medicamentos na replicação do HBV. No entanto, precisam ser realizadas utilizando-se métodos sensíveis para um diagnóstico precoce e detecção de baixas cargas virais, como nos casos de hepatite B oculta. Os métodos comerciais tem custo alto para países em desenvolvimento como o Brasil. Dessa forma, é importante a avaliação de metodologias in-house com boa sensibilidade, fácil execução e baixo custo. Além disso, o uso de amostras de fluido oral é interessante para indivíduos com acesso venoso difícil, como crianças, usuários de drogas intravenosas e hemodialisados. OBJETIVO: Esse estudo tem como objetivo otimizar métodos moleculares para detecção e quantificação do HBV DNA em amostras de soro e fluido oral. METODOLOGIA. Foram conduzidos quatro trabalhos: No primeiro estudo, foram incluídos 228 amostras de soro de indivíduos com hepatite B subdivididos em 3 grupos para avaliação de 3 métodos qualitativos in-house. No segundo trabalho, 74 indivíduos (32 HBsAg reagentes e 42 sem nenhum marcador de hepatite B) forneceram amostras de soro e fluido oral obtidas por quatro diferentes métodos (Salivette, FTA Card, cuspe e DNA-Sal), para determinação do coletor mais apropriado para detecção qualitativa do HBV DNA. No terceiro estudo, 45 indivíduos com HBsAg não reagente, anti-HBc reagente e anti-HBs não reagente forneceram amostras de soro e fluido oral para detecção do HBV DNA para identificação de hepatite B oculta E no quarto trabalho, 103 indivíduos (55 HBsAg reagentes e 48 sem nenhum marcador para hepatite B) forneceram amostras de soro e fluido oral para a avaliação de um método de PCR em tempo real in-house que utiliza uma curva padrão sintética. RESULTADOS. No primeiro estudo, a semi-nested PCR para amplificação do gene S do HBV apresentou os melhores resultados entre os métodos qualitativos em comparação aos testes comerciais (Cobas Amplicor HBV Monitor e Cobas TaqMan HBV, Roche Diagnostics). No segundo estudo, o HBV DNA foi detectado em fluido oral coletado por 4 técnicas distintas, com maior sensibilidade do dispositivo Salivette, seguido pelo FTA Card, cuspe e DNA-Sal. Houve maior detecção do HBV em fluido oral cujas respectivas amostras de soro possuem carga viral elevada. No terceiro estudo, o HBV DNA foi detectado em cinco amostras de soro e em quatro amostras de fluido oral dos indivíduos anti- HBc reagentes (o limite de detecção de fluido oral foi de 1,656 log UI/mL no soro pareado). No quarto trabalho, o método de PCR em tempo real com curva sintética desenvolvido apresentou 85% de concordância com o teste comercial usando amostras de soro, e foi possível detectar o HBV DNA em amostras de fluido oral. CONCLUSÕES. As metodologias in-house qualitativas e quantitativas avaliadas nesse estudo podem ser alternativas para a triagem inicial de amostras em laboratórios com poucos recursos financeiros. O coletor Salivette foi determinado como o mais eficiente para detecção do HBV DNA principalmente quando as respectivas amostras de soro possuem alta carga viral como também de pacientes com hepatite B oculta. Dessa forma, este tipo de amostra poderia ser útil para detecção do HBV DNA em determinados grupos como para identificação de casos de hepatite B oculta, podendo ser utilizado como alternativa à coleta de sangue em pacientes com acesso venoso difícil