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CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR EM CÃES FRENTE A NOVOS ANTÍGENOS DE LEISHMANIA INFANTUM
Leishmania infantum
Cães
Antígenos de Protozoários
Proteínas Recombinantes
Sangue/parasitologia
Células Th1/imunologia
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo
Real/métodos
Silva, Lays Adrianne Mendonça Trajano | Data do documento:
2017
Título alternativo
Characterization of the cellular immune response in dogs opposite to new antigens of Leishmania infantumAutor(es)
Orientador
Coorientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Resumo
A resposta imune na Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é importante para o controle e a
cura da infecção. Dentro desse contexto, proteínas que estimulam um perfil do tipo Th1, tem
sidoexplorada como candidatos vacinais. Desta forma, o objetivo deste estudo foiavaliar a
resposta imune celular decães frente a novas proteínas recombinantes, para obtenção de
subsídios científicos que direcionem estudos de vacinologia. Para isto amostras de sangue de
cães com LV residentes em área endêmica em Pernambuco foram coletadas. Um estudo piloto
foi realizado para escolha dos estímulos in vitro, bem como concentrações antigênicas e
tempo de cultivo. Após separação das células mononucleares do sangue periférico (PBMC),
as células foram submetidas ao estímulo com antígenos Lci10, Lci13 e a proteína quimérica
Q1 nas concentrações de 2,5µg/mL, 5µg/mL e 10µg/mL, e antígeno bruto solúvel de L.
infantum (LSA) nas concentrações de 10µg/mL e 25µg/mL por 24h, 48h e 72h. Ao fim do
tempo de cultivo o RNA total foi extraído e uma transcrição reversa para cDNA foi realizada
para avaliação da expressão gênica para as citocinas IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-10 e TGF-β
através do método de Ct comparativo por RT-PCR em tempo real. Para o LSA a concentração
de 25µg/mL foi escolhida, por apresentar uma melhor expressão das citocinas tanto do perfil
Th1, quanto Th2. O PBMC que foi estimuladocom a Lci13 (5µg/mL em 24h de
cultivo),apresentou um o perfil protetor (Th1) quando comparado com o LSA. Por esta razão,
este antígeno foi escolhido para análise nos grupos de estudo. Após, estabelecimento das
condições de cultivo, 19 cães foram incluídos em nosso estudo, sendo 7 para o grupo controle,
7 para o grupo sintomático e 5 para o grupo assintomático. Foi observado que apesar de não
haver diferenças estatísticas significativas entre os grupos analisados, de forma descritiva o
estímulo da Lci13 em animais controle foi bastante promissor, com a expressão positiva para
IFN-ɣ e TNF, além da presença da IL-10 atuando como regulador da resposta imune, e uma
expressão negativa para TGF-β. Além disso, a correlação entre IFN-ɣ e TNF (p=0,042) e
IFN-ɣ e IL-10 (p=0,049) foi significativa e indicou uma forte correlação positiva entre as
citocinas. Para os grupos sintomáticos e assintomáticos apenas o TNF foi expresso de forma
positiva, havendo uma supressão de TGF-β. A partir dos resultados obtidos, o estudo foi
capaz de fornecer subsídios científicos com relação a imunologia na LVC. O antígeno Lci13
em cães controle apresentou um bom desempenho, abrindo espaço para novas pesquisas para
desenvolvimento de uma vacina profilática.
Resumo em Inglês
The immune response in Visceral Canine Leishmaniasis (VCL) is important for the control
and cure of infection. In this regards, proteins that stimulate a Th1-type profile have been
explored as vaccine candidates. In this way, the objective of this study was to evaluate the
cellular immune response of dogs against new recombinant proteins, to obtain scientific
subsidies that guide vaccination studies. For this, blood samples from dogs with LV residing
in an endemic area in Pernambuco was performed. A pilot study was conducted to select in
vitro stimuli, as well as antigenic concentrations and culture time. After separation
ofPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), the cells were challenged with Lci10, Lci13
antigens and Q1 chimeric protein atthe 2.5μg/mL, 5μg/mL and 10μg/mL, and soluble crude
antigen from L. infantum (LSA) at 10μg/mL and 25μg/mL for 24h, 48h and 72h. At the end of
the culture time the total RNA was extracted and a cDNA reverse transcriptase was performed
to evaluate the gene expression for the cytokines IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-10 and TGF-β,
through comparative Ct method by RT-PCR in real time. For the LSA, the concentration of
25μg/mL was chosen, since it had a better expression of the cytokines of both Th1 and Th2
profiles. PBMC cultures challenged with Lci13 antigen (5μg/mL, 24h) presented the best
protective cytokines expression profile (Th1) compered to LSA. For this reason this antigen
was choosen for futher analyses on studied dogs groups. After the establishment of culture
conditions, 19 dogs were included in our study, 7 for the control group, 7 for the symptomatic
group and 5 for the asymptomatic group. Although there were no statistically diference
between analyzed groups,animal challenged with Lci13 demonstrated to be very promissing
with positive expression. For IFN-ɣ and TNF. In addition, this dogs also presented IL-10
acting, as regulator of the immune response, and a negative expression for TGF-b. The
correlation between IFN-ɣ and TNF (p = 0.042) and IFN-ɣ and IL-10 (p = 0.049) was
significantindicating a positive correlation between the cytokines. For the symptomatic and
asymptomatic groups only TNF was expressed positively, with a suppression of TGF-β. From
the results obtained, the study was able to provide scientific subsidies regarding the
immunology of VCL. The Lci13 antigen in control dogs presented a good performance, open
field for further researchson develop a prophylactic vaccine.
DeCS
Leishmaniose Visceral/imunologiaLeishmania infantum
Cães
Antígenos de Protozoários
Proteínas Recombinantes
Sangue/parasitologia
Células Th1/imunologia
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo
Real/métodos
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