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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23875
ESTUDO DA FUNÇÃO DOS GRÂNULOS QUE CONTÊM TIA E DOS PROCESSING BODIES EM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS.
RNA-Binding Proteins
Cell Differentiation
Cytoplasmic Granules
Mesenchymal Stromal Cells
Proteínas de Ligação a RNA
Diferenciação Celular
Grânulos Citoplasmáticos
Células Mesenquimais Estromais
Cofré, Axel Helmut Rulf | Data do documento:
2015
Autor(es)
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Resumo
Messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs) são complexos formados por RNA mensageiro (mRNA) e um pool de diferentes proteínas que se ligam diretamente ou indiretamente ao mRNA. Proteínas diferentes podem formar diferentes mRNPs com diferentes funções. Agregação de mRNPs formam grânulos que são visíveis ao microscópio. Dois desses grânulos comumente encontrados em células eucarióticas são os processing bodies (PB) e os grânulos de estresse (GE) possuem função fundamental na regulação pós-transcricional, mais especificamente, na degradação (PB) e na estocagem (PB e GE) do mRNA. Enquanto os PB são constitutivamente encontrados, GE são vistos somente em condições de estresse. TTP e RCK são componentes presentes em ambos os grânulos enquanto que TIA1 e TIAR são exclusivos de GE e DCP2 exclusivo de PB. Human Adipocyte Derived Stem Cells (ADSCs) são células-tronco adultas multipotentes com capacidade de autorrenovação e diferenciação em células de diversos tecidos. Desde que pouco se sabe sobre a função dos PB e dos GE durante a diferenciação das células-tronco, nosso objetivo é elucidar a dinâmica e função desses grânulos nestas celulas. Foram utilizadas ADSCs derivadas de cirurgia bariátrica e lipoaspiração. Diversos componentes de PB e de GE foram analisados por Imunofluorescência após 1, 4, 7 e 12 dias de diferenciação adipogênica. Oligos de RNA de interferência (siRNA) específicos para RCK, DCP2, TTP, TIAR e TIA1 foram transfectados concomitantemente com a indução à diferenciação adipogênica e as culturas mantidas por 1, 4, 7 e 14 dias de diferenciação. A diferenciação foi mensurada por intensidade de fluorescência após marcação com AdipoRed. GE são ausentes em ADSCs indiferenciadas e durante a diferenciação como determinado por imunomarcação com TIAR que se localiza predominantemente no núcleo. Interessantemente imunomarcação com TIA1/R mostrou que ADSCs possuem grande quantidade de grânulos contendo TIA1/R em células indiferenciadas e não estressadas. Sob estresse oxidativo há um aumento de PB em ADSCs e a formação de GE. Esses grânulos parecem variar de composição, uma vez que eIF4E é ausente e GE imunomarcados com eIF4B são mais perinucleares do que GE imunomarcados com TIAR. PB variam em número e tamanho em células diferenciadas. Notavelmente, em ADSCs possuem poucos PB e até mesmo ausente em algumas células, além disso, TIA1/R e PB significativamente aumentam após 24 horas de diferenciação e após 12 dias o número de PB é similar a células diferenciadas enquanto que os grânulos de TIA1/R praticamente desaparecem. siRNA de componentes essenciais de PB e GE em ADSCs indiferenciadas (tempo 0) mostrou que há um aumento significativo na diferenciação em adipócito após 4, 7 e 12 dias de diferenciação adipogênica. Interessantemente esse aumento se deu pela maturação do adipócito, i.e. tamanho da vesícula de lipídio e não pelo aumento da quantidade de células diferenciadas. Nossos dados mostram que PB estão em baixo número e que existem grânulos de TIA1/R citoplasmático nunca antes mostrados em ADSCs indiferenciadas. Ainda, esses grânulos aumentam durante a diferenciação e parecem exercer um papel importante na maturação dos adipócitos uma vez que ensaios de siRNA de componentes de PB e GE levam a uma diferenciação mais acelerada. Também, os GE são formados após indução a estresse oxidativo e esses grânulos são praticamente ausentes de eIF4E mostrando que a composição desses grânulos varia em relação a células diferenciadas.
Resumo em Inglês
Messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes formed by messenger RNAs (mRNAs) and a pool of different proteins bound directly or indirectly to the mRNA. Different proteins might form different mRNPs with different functions. Aggregations of mRNPs form granules that are visible to the microscope. Two types of granules commonly found in eukaryotic cells are the Processing Bodies (PB) and the Stress Granules (SG). They have essential roles on posttranscriptional regulation, more specifically on degradation (PB) and storage (PB and SG) of the mRNA. While PB are constitutively observed, SG are seeing only during stress conditions. TTP and RCK are a component present in both granulesTIA1 and TIAR are exclusively SG. Human Adipocyte Derived Stem Cells (ADSCs) are adult multipotent stem cells with the capability of selfrenewal and differentiation in several tissue cell types. Since cell differentiation induction is stressful for the cell and little is known about the role of those granules during stem cells proliferation and differentiation, our goal is to elucidate the dynamic and function of those granules in stem cells. ADSCs were used. Multiples PB and SG protein components were analyzed by immunofluorescence after 1, 4, 7 and 12 days of adipogenic differentiation. Specific siRNA oligos for RCK, DCP2, TTP, TIAR and TIA1 were transfected and immediately induced to adipogenic differentiation for 24 hours, 4, 7 and 14 days of differentiation with specific adipogenic media. Differentiation was measured by fluorescence intensity after staining with AdipoRed. SGs were absent in undifferentiated or differentiated ADSCs as determined by TIAR immunolabeling which localized mainly in the nucleus. Interestingly TIA1/R immunolabeling showed that ADSC have abundant TIA1/R granules on undifferentiated and unstressed cells. Under oxidative stress ADSC have an increase of PB and the formation of SGs. These SG may vary in composition since eIF4E is absent and eIF4B immunolabeled SGs are more perinuclear than TIAR immunolabeled SGs. PB varied in number and size on differentiated cells. Remarkably, in ADSC there is a very low number of PB and is even absent in some cells although, TIA1/R and PB significantly increases after 24 hour of differentiation and after 12 days the number of PB are similar to differentiated cells while TIA1/R almost disappears. siRNA of PB and SG essential components in undifferentiated ADSCs (time 0) showed that there is a significant increase of adipocyte differentiation after 4, 7 and 14 days of adipogenesis induction. Interestingly, this increase was due to adipocyte maturation, i.e. size of lipid vesicles, and not to the number of differentiated cells. Our data show that PB are in low number and, was never shown before that ADSCs have TIA1/R cytoplasmic granules in undifferentiated cells. There is an increase of PB and TIA1/R granules during differentiation and those granules seems to be important for late adipocyte maturation once siRNA of PB and SG components drives to an early differentiation. Also, SG are formed after oxidative stress induction and those granules are almost deprived of eIF4E showing that the composition of those granules may vary when comparing to differentiated cells.
Palavras-chave
Células-Tronco Mesenquimais HumanasPalavras-chave em inglês
Stem CellsRNA-Binding Proteins
Cell Differentiation
Cytoplasmic Granules
Mesenchymal Stromal Cells
DeCS
Células-TroncoProteínas de Ligação a RNA
Diferenciação Celular
Grânulos Citoplasmáticos
Células Mesenquimais Estromais
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