Análise comparativa do proteoma e fosfoproteoma de cepas de Leishmania (Viannia) braziliensis com resistência/susceptibilidade natural ao óxido nítrico

Abstract

Espécie autóctone do Novo Mundo, Leishmania (Viannia) braziliensis é um dos principais agentes etiológicos da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no continente Americano e no Brasil. A LTA causada por esta espécie pode resultar em diferentes manifestações clínicas que envolvem desde lesões cutâneas autolimitantes até formas disseminadas e mucosas desfigurantes. A forma clínica é definida pelo parasito infectante e pela resposta imune do hospedeiro. A produção de citocinas, espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), especialmente óxido nítrico (NO), normalmente acarretam a destruição do microorganismo fagocitado, porém alguns isolados apresentam resistência natural a estas espécies reativas, principalmente ao NO. As cepas de L. (V.) braziliensis estudadas nesta tese foram anteriormente caracterizadas como sendo naturalmente resistentes ou susceptíveis ao NO. A cepa resistente, também foi responsável pela forma clínica mucocutânea e causou lesões cutâneas maiores do que a cepa sensível. Além disso, a cepa resistente ao NO apresentou também refratariedade ao tratamento com antimonial, ao passo que a cepa susceptível foi responsiva. Entretanto, as moléculas e vias metabólicas do parasito que governam esta resistência/susceptibilidade ainda são desconhecidas. Assim, o objetivo desta tese foi avaliar quais fatores contribuem para o perfil de resistência/susceptibilidade natural ao NO nas cepas de L. braziliensis, mediante uma análise quantitativa comparativa de genes envolvidos na metabolização do ROS e RNS e do proteoma e fosfoproteoma destas cepas. Os resultados mostram que as cepas apresentam diferenças significativas de resistência frente ao NO in vitro, mas não frente a ROS Genes das vias das poliaminas, via das pteridinas e enzimas antioxidantes foram diferencialmente expressos ao longo da curva de crescimento das cepas, assim como alteraram sua expressão quando os parasitos foram expostos ao tratamento com NO. A triparedoxina peroxidase, uma importante enzima do metabolismo redox do parasito, apresentou uma expressão duas vezes maior na cepa resistente, ao nível de transcritos; porém, análise dos níveis desta proteína em ambas as cepas, usando Western blotting, não corroborou essa diferença. Análise por espectrometria de massas das cepas tratadas ou não com NO nos permitiu obter o maior proteoma e fosfoproteoma descrito para uma espécie de Leishmania até o momento, com aproximadamente 6.500 proteínas identificadas e cerca de 2.000 fosfoproteínas e 4.655 fosfosítios identificados para L. braziliensis. Análise estatística das diferenças quantitativas entre a cepa resistente e a cepa susceptível, tratadas ou não com NO revelou que estas apresentam diferenças significativas (i) em seu proteoma; (ii) seu conteúdo de proteína total por célula; (iii) na abundância de proteínas envolvidas em replicação, transcrição, tradução, homeostase mitocondrial e sinalização via cinases e fosfatases; (iv) na abundância de transportadores de membrana associados à resistência ao antimonial; (v) de proteínas implicadas diretamente na resistência ao óxido nítrico e (vi) na abundancia de fosfoproteínas. Estes resultados sugerem que a cepa naturalmente resistente ao óxido nítrico apresenta uma proliferação celular diferenciada, uma rápida e eficiente resposta ao estresse com NO em termos de síntese de proteínas e sinalização, e uma mitocôndria mais resistente ao estresse nitrosativo que, em conjunto, contribuem ao seu fenótipo de resistência natural frente à resposta imune do hospedeiro mediada pelo NO.