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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/19685
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CLONAGEM, EXPRESSÃO HETEROLÓGICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS ENZIMAS GLICONATO CINASE E URACIL FOSFORRIBOSILTRANSFERASE DE TRYPANOSOMA CRUZI
Castilho, Vanessa de Vasconcelos Sinatti | Data do documento:
2013
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
A doença de Chagas é um problema de saúde pública na América Latina, com um forte impacto no Brasil. De acordo com estimativas da Organização Panamericana de Saúde (OPAS), em torno de 8 milhões de pessoas nas Américas estão infectados pelo Trypanosoma cruzi, com uma taxa de mortalidade de 12.000 indivíduos por ano. Apesar desta situação, os medicamentos utilizados no tratamento desta doença são ativos somente na fase aguda, apresentam uma baixa eficácia e uma série de efeitos colaterais. Portanto, a busca por novos alvos terapêuticos, através do estudo do metabolismo de T. cruzi, é uma alternativa no desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, utilizou-se o AnEnPi, uma ferramenta computacional capaz de identificar e classificar proteínas com uma potencial atividade enzimática, utilizando dados genômicos previamente publicados, permitindo a reconstrução de diferentes vias metabólicas. Por meio dessa abordagem foram identificados em T. cruzi duas proteínas, as quais apresentam as seguintes atividades enzimáticas: uracil fosforibosiltransferase (UPRT) e gliconato cinase (GK). A UPRT é uma enzima da via de salvação de pirimidinas que converte uracil e D-5-fosforibosil-1-fosfato (PRPP) a monofosfato de uridina (UMP) e pirofosfato (PPi). E a GK é uma enzima da via das pentoses-fosfato que catalisa a fosforilação de gliconato a 6-fosfogliconato
Análises das sequências genômicas codificante para essas proteínas, utilizando diferentes ferramentas de bioinformática, permitiram a identificação de dois genes para cada uma dessas atividades enzimáticas em T. cruzi e confirmaram essas atividades pela identificação de seus motivos estruturais. Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular das enzimas GK e UPRT de T. cruzi, através da clonagem dos respectivos genes, utilizando os vetores pBAD-TOPO TA e pET28a, e da expressão heteróloga em Escherichia coli, cepa BL21(DE3). As proteínas recombinantes GK e UPRT foram expressas na fração solúvel e insolúvel com pesos moleculares aproximados de 23 kDa e 28 kDa, respectivamente. Essas proteínas recombinantes foram purificadas sob condições desnaturantes através de cromatografia de afinidade. Os soros policlonais produzidos contra as proteínas purificadas foram eficazes no reconhecimento das proteínas recombinantes e de suas formas nativas presentes na forma epimastigota de T. cruzi. O ensaio de imunofluorescência revelou que as enzimas GK e UPRT estão localizadas possivelmente no citoplasma e no interior de vesículas citoplasmáticas ao longo do parasita Além disto, a estrutura de ambas as enzimas foi deduzida através de modelagem por homologia. Este trabalho visa contribuir para o melhor entendimento do metabolismo deste parasita, de forma a auxiliar na busca de novos alvos terapêuticos contra a doença de Chagas.
Resumo em Inglês
Chagas’ disease is a public health problem in Latin America with a strong impact in Brazil. According to estimates by the Pan American Health Organization (PAHO), around 8 million people in the Americas are infected with Trypanosoma cruzi with rate of 12,000 deaths per year. Despite this situation, the drugs used for treating this disease are active only in the acute phase and have low efficiency and many side effects. Therefore, search for new therapeutic targets, by studying the metabolism of T. cruzi, is an alternative for the development of new drugs. In this context, we used AnEnPi, a software tool able to identify and classify proteins with a potential enzymatic activity using genomic data previously published, allowing the reconstruction of different metabolic pathways. Through this approach two proteins
were identified in T. cruzi, which have the following enzymatic activities: uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) and gluconate kinase (GK). UPRT is a pyrimidine salvage enzyme that converts uracil and 5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate (PRPP) to uridine monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). GK is an enzyme of the pentose phosphate pathway that catalyses the phosphorylation of Dgluconate to 6-phospho-D-gluconate. Analysis of genomic sequences encoding for this proteins using various bioinformatic tools allowed the identification of two genes for each enzyme in T. cruzi and confirmed these activities by identifying their structural motifs. Subsequently, we performed the molecular characterization of the enzymes GK and UPRT of T. cruzi, by cloning the respective genes using the vector pBAD-TOPO and pET28a, and heterologous expression in E. coli, strain BL21 (DE3). The recombinant proteins GK and UPRT were expressed in the insoluble and soluble fraction with approximate molecular weights of 23 kDa and 28 kDa, respectively. These recombinant proteins were purified under denaturating conditions by affinity chromatography. The polyclonal antisera raised against the purified proteins were effective in the recognition of recombinant proteins and their native forms present in the epimastigote form of T. cruzi. The immunofluorescence assay revealed that GK and UPRT enzymes were possibly located in the cytoplasm and inside cytoplasmic vesicles along the parasite. Moreover, the structure of both enzymes was deduced by homology modeling. This work aims to contribute to a better understanding of the parasite’s metabolism in order to help with the search for new therapeutic targets against Chagas’ disease.
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