Hidroxiureia na doença falciforme: influência de polimorfismos nos genes MPO e SERPINA1 e implicações nas vias dos receptores tipo Toll e do Inflamassoma

Abstract

Introdução: A doença falciforme (DF) é uma condição inflamatória associada a crises vaso-oclusivas e hemólise intravascular. Os polimorfismos nos genes SERPINA1 e mieloperoxidase (MPO) -463G>A estão associados a complicações vasculares na DF. Pacientes com DF são tratadas com hidroxiureia (HU), que aumenta os níveis de hemoglobina fetal (HbF) e diminui a contagem de leucócitos. Os receptores do tipo Toll (TLR) desempenham papel importante na manutenção do estado inflamatório observado nestes pacientes e o inflamassoma associado à proteína 3 do receptor tipo NOD (NLRP3) poderia contribuir para essa inflamação, uma vez que o conteúdo eritróide atua como sinais de perigo (eDAMPs) para ativar esta via. Objetivos: O objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possível interferência de polimorfismos nos genes da MPO e SERPINA1 em pacientes com DF na resposta ao tratamento com HU e investigar se esse tratamento pode interferir na expressão gênica de TLR e NOD induzida por hemácias dos pacientes com anemia falciforme (AF). Os objetivos específicos foram avaliar a associação entre esses polimorfismos e aspectos clínicos e laboratoriais em resposta ao tratamento com HU; a expressão de TLR2, TLR4, TLR5 e TLR9 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com AF e o papel que os eritrócitos desempenham na indução da expressão dos TLR, e o efeito in vitro da HU; investigar a expressão de NLRP3, caspase-1, interleucina (IL)-1β e IL-18 em PBMC de pacientes com AF e o papel que os eritrócitos exercem na expressão dessas moléculas, além do efeito in vitro da HU. Métodos: Foram analisadas amostras de sangue de 356 pacientes com DF e 100 voluntários saudáveis. Sessenta e nove pacientes foram rastreados para o polimorfismo -463G>A MPO e 129 para SERPINA1 por métodos baseados em PCR e enzimas de restrição. PBMC e hemácias de pacientes com AF (SS-RBC) e voluntários saudáveis (AA-RBC) foram obtidos. PBMCs foram estimulados com SS- ou AA-RBC na presença de HU. Expressões gênicas de TLRs e NOD foram avaliadas por qPCR. As produções de leucotrieno-B4 (LTB4), IL-1β e proteína ligadora (BP) de IL-18 foram determinadas por ELISA, e a produção de nitrito foi medida pela reação de Griess. Resultados: Entre os pacientes com DF em uso de HU, aqueles com o polimorfismo para MPO apresentaram níveis aumentados de ferritina e de HbF, ao passo que estes parâmetros não estiveram alterados em pacientes tratados e sem o polimorfismo. Em contraste, pacientes com DF com polimorfismo SERPINA1 apresentaram aumento dos níveis de ferritina e diminuição dos níveis de alfa-1 antitripsina (AAT). O tratamento com HU coincidiu com níveis elevados de ferritina em ambos os grupos, ao passo que os níveis de AAT foram reduzidos apenas no grupo mutante. Os pacientes tratados com HU sem polimorfismo SERPINA1 apresentaram redução na contagem de leucócitos e nos níveis de AAT. TLR2, TLR4 e TLR5 estiveram altamente expressos em PBMC de pacientes com AF, em comparação com voluntários saudáveis, enquanto a expressão de TLR9 foi similar em ambos os grupos. Além disso, hemácias intactas de pacientes com AF ou submetidas à lise (SS-RBC), mas não dos voluntários sadios (AA-RBC), induziram a expressão de TLR9, e tanto as AA- quanto SS-RBC lisadas induziram a expressão de TLR2, TLR4 e TLR5. Curiosamente, o tratamento com HU aumentou a expressão de TLR2 e não interferiu na expressão de outros TLRs. Embora SS-RBC induza produção de LTB4 e de nitrito, a HU não impede secreção de LTB4, mas reduz a produção de nitrito. NLRP3 e IL-1β são altamente expressos em PBMC de pacientes com AF quando em comparação com voluntários saudáveis. Adicionalmente, mostramos que SS-RBC intactas ou submetidas à lise, mas não AA-RBC, induziram a expressão de caspase-1 e IL-18, e AA-RBC lisadas induziram a expressão de NLRP3 e IL-1β. Os SS-RBCs íntegros, mas não AA-RBCs, induziram a produção de IL-1β. O tratamento com HU não interferiu na expressão de proteínas do inflamassoma associado ao NLRP-3, ao passo que induziu a produção de IL-18BP. Conclusão: Estes resultados em conjunto indicam que as alterações genéticas, tais como polimorfismos em genes de MPO e SERPINA1, interferem na resposta ao tratamento com HU. Também ficou evidente que hemácias, especialmente SS-RBC, agem como eDAMPs, estimulando a expressão de TLR e NOD, contribuindo para a inflamação. O uso de HU não impede a inflamação dependente de TLR e da plataforma do inflamassoma associada ao NLRP3. Estes conhecimentos podem levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que atuem em vias diferentes daquelas observadas para HU.