Avaliação de biomarcadores de gravidade em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum classificados clinicamente e estratificados quanto à carga parasitária em estudos de corte transversal.

Abstract

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV) é, principalmente, causada pelo protozoário Leishmania infantum nas Américas, podendo acometer o Homem e animais. Dentre estes, o cão é considerado o principal reservatório doméstico do parasito. O curso da LV canina (LVC) varia entre os animais, podendo alguns se mostrar resistentes à infecção, se mantendo subclínicos, e outros susceptíveis, que irão desenvolver sinais da doença. O estado de resistência ou susceptibilidade à LVC reflete na gravidade da infecção do animal, e não pode ser definido pelo quadro clínico apresentado ou por qualquer parâmetro isolado de resposta imune. OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária como biomarcador parasitológico, as proteínas LJM11/LJM17 como biomarcadores de exposição à saliva do vetor, e identificar biomarcadores inflamatórios de gravidade da infecção por L. infantum em cães. Primeiramente, foi realizada a padronização de uma ferramenta diagnóstica de PCR quantitativa (qPCR), utilizando diferentes amostras biológicas (aspirado esplênico, linfonodos, pele, sangue, medula óssea e swab conjuntival) de cães sintomáticos provenientes da área endêmica de Jequié-BA. A avaliação da carga parasitária de L. infantum teve seu desempenho comparado com outras técnicas diagnósticas (cultura de aspirado esplênico, teste rápido e ELISA para LVC) empregando a análise de classe latente (ACL). Para essa análise, foi construída uma variável latente a ser empregada como padrão ouro para avaliação da acurácia desses métodos. Na avaliação inicia dos cães sintomáticos, a qPCR detectou DNA do parasita em 100% dos animais em pelo menos uma das amostras biológicas, sendo que todos foram positivos empregando-se o aspirado esplênico e 70% empregando-se o sangue. Utilizando a variável latente como padrão-ouro, a sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico (95,8%) foi maior do que as obtidas pela qPCR utilizando outras amostras biológicas e por outros testes diagnósticos. Desta forma, em uma segunda etapa, a acurácia da qPCR empregando-se aspirados esplênicos foi avaliada em uma amostra canina obtida de forma randômica (n = 800), coletada durante um estudo de corte transversal na área endêmica de Camaçari-BA. Utilizando a variável latente como padrão-ouro, novamente a sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico foi elevada (95%). Neste estudo de corte transversal foi possível também correlacionar a carga parasitária com a gravidade da infecção, existindo associação positiva significativa entre a intensidade da carga parasitária no baço e o número de sinais clínicos presentes nos cães. Nessa primeira parte do estudo, foi possível demonstrar que i) a utilização de aspirado esplênico na qPCR apresentou maior sensibilidade na detecção de DNA de L. infantum do que outras amostras biológicas; ii) a ACL pode ser usada para gerar um padrão ouro adequado para avaliação de técnicas diagnósticas, uma vez que esta técnica oferece uma avaliação mais completa dos resultados obtidos por diferentes métodos diagnósticos para LVC e iii) a carga parasitária se mostrou um bom biomarcador de gravidade clínica nos animais infectados por L. infantum. Posteriormente, após a reação de qPCR ter sido padronizada e validada empregando-se aspirados esplênicos, esta foi aprimorada para utilização em estudos epidemiológicos, sendo padronizada em formato duplex tanto na forma líquida como no formato em gel (ready-to-use), adicionando-se à reação primers específicos para a detecção simultânea de um gene constitutivo canino. Esse protocolo permitiu a detecção de até 0,1 parasitas por amostra. Adicionalmente, a detecção de DNA do hospedeiro na mesma reação simultaneamente fortaleceu o diagnóstico da LVC, agindo como controle interno da reação, reduzindo tempo de execução e diminuindo custos da reação. Após a padronização da qPCR duplex, foi realizado um estudo exploratório de uma amostra de cães coletada durante outro estudo de corte transversal, em Camaçari-BA, no qual se objetivou avaliar biomarcadores de exposição à saliva do vetor (proteínas LJM11/LJM17) e identificar biomarcadores inflamatórios, correlacionando-os à gravidade da LVC e à carga parasitária. A análise identificou uma bioassinatura distinta em cães com diferentes manifestações clínicas, caracterizada por uma diminuição dos níveis de LTB4 e de PGE2 e um aumento de CXCL1 e CCL2, de acordo com o agravamento da doença. Além disso, utilizando uma combinação de 3 parâmetros distintos (LTB4, PGE2 e CXCL1) como um marcador, este permitiu a discriminação entre escores clínicos diferentes utilizando uma curva ROC. Foi detectado também, que cães com escores clínicos elevados apresentaram-se, mais frequentemente, positividade para anticorpos anti-saliva e elevadas cargas parasitárias. Este estudo permitiu a avaliação e identificação de vários biomarcadores em cães, que podem ser importantes para auxiliar na avaliação do curso da doença e prognóstico por médicos veterinários, além de futuramente poder ajudar na distinção entre cães resistentes ou susceptíveis direcionando estratégias de controle da LVC em áreas endêmicas. CONCLUSÃO: Existem biomarcadores parasitológicos como a carga parasitária, biomarcadores imunológicos e inflamatórios como CXCL1, CCL2, LTB-4, PGE-2, além da produção de anticorpos específicos contra as proteínas LJM 11 e LJM 17 da saliva do vetor, que são capazes de diferenciar animais infectados por L. infantum de acordo com seus diferentes quadros clínicos.