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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/17695
INFECÇÃO POR LEISHMANIA MODULA A ATIVAÇÃO DE BETA-1 INTEGRINAS E ALTERA A CINÉTICA DO ESPALHAMENTO CELULAR DE MONÓCITOS SOBRE FIBRONECTINA
Carvalhal, Djalma Gomes Ferrão | Data do documento:
2016
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Resumo
A leishmaniose é considerada como um grupo de doenças, causadas por parasitos do gênero Leishmania. O gênero inclui mais de 20 espécies de parasitos que são transmitidas ao homem pela picada da fêmea, infectada, dos insetos da família dos flebotomíneos e as diferentes espécies estão associadas a diferentes manifestações clínicas da doença. Uma característica marcante na infecção é a presença de macrófagos infectados no sítio de inoculação do parasito e em órgãos internos do hospedeiro. Estudos prévios, demonstraram que a infecção de fagócitos mononucleares com Leishmania amazonensis, L. infantum ou L. braziliensis promove uma diminuição na adesão celular ao tecido conjuntivo inflamado da pele. Esta diminuição da adesão é decorrente, principalmente, de mecanismos envolvidos na regulação da molécula VLA-4, uma integrina da família beta 1 que se liga à VCAM-1, trombospondina e à molécula fibronectina presente na matriz extracelular. Neste trabalho, estudamos os estágios iniciais e tardios da formação da ligação entre a molécula VLA-4 e fibronectina em ensaios de adesão celular com monócitos humanos infectados por L. amazonensis. O estágio inicial do processo de adesão celular (rolamento) foi avaliado através de ensaios com câmaras de fluxo laminar. Os resultados demonstraram que a função da integrina VLA-4 está preservada nos monócitos infectados quando comparado ao grupo de células não infectadas. A fase tardia do processo de adesão celular foi avaliada mensurando a área de espalhamento citoplasmático, por microscopia eletrônica de varredura, e avaliando a cinética de espalhamento citoplasmático por microscopia de interferência e reflexão (IRM). Nos ensaios avaliados por microscopia de varredura, os monócitos infectados apresentaram uma diminuição da área de espalhamento citoplasmático sobre fibronectina com uma área mediana de 41 (34-51) μm2 em comparação com grupo de células não infectadas, que apresentaram área mediana de 72 (55-89) μm2. O espalhamento citoplasmático foi inibido usando um anticorpo anti-VLA4 para bloquear a ligação desta molécula com o substrato. Nos ensaios de IRM, após o contato inicial com a superfície revestida de fibronectina, os monócitos não infectados espalharam o citoplasma rapidamente na proporção de 15 μm2 s-1, enquanto os monócitos infectados com L. amazonensis mantiveram pequenos contatos na proporção de 5,5 μm2 s-1. Após a avaliação das fases iniciais e tardias do processo de adesão, foi realizada, através de citometria de fluxo, a análise da expressão do epítopo de alta afinidade da molécula VLA-4 de monócitos não infectados e infectados com L. amazonensis. As células infectadas tiveram uma diminuição da expressão de VLA-4 de 39 ± 21% para 14 ± 3%; e LFA1 de 37 ± 32% para 18 ± 16%. Os nossos dados demonstram que a infecção por L. amazonensis não altera as fases iniciais, fase de rolamento, do processo de adesão, mas afeta as fases tardias, adesão firme, uma vez que mantem as moléculas de integrinas em estados de baixa afinidade e impede o espalhamento citoplasmático dos monócitos infectados. Desta forma, os efeitos observados na função das integrinas pode ter um papel relevante na retenção ou migração de leucócitos do sítio de infecção para o linfonodo drenante bem como nas sinapses imunológicas durante a apresentação de antígenos. Contudo, mais estudos são necessários para comprovar estas hipóteses.
Resumo em Inglês
Leishmaniasis is considered a group of diseases, caused by parasites of the genus Leishmania. The genus includes more than 20 species of parasites that are transmitted to humans by the bite of vector female insect, of the phlebotomine family, and the different species are associated with different clinical manifestations of the disease. A striking feature of infection is the presence of infected macrophages at the site of inoculation of the parasite and internal organs of the host. Previous studies have demonstrated that infection of mononuclear phagocytes with Leishmania amazonensis, L. infantum or L. braziliensis promotes a decrease in cellular adhesion to the inflamed connective tissue of the skin. This decrease in adhesion results mainly from mechanisms involved in the regulation of the VLA-4 molecule, a beta 1 integrin that binds to VCAM-1, thrombospondin and the fibronectin molecule present in the extracellular matrix. In this work, we study the early and late stages of the binding formation between VLA-4 and fibronectin molecule in cell adhesion assays with human monocytes infected by L. amazonensis. The initial stage of the cell adhesion (rolling) process was evaluated through laminar flow chamber assays, the results demonstrated that VLA-4 integrin function is preserved in infected monocytes when compared to the uninfected cell group. The late phase of the cell adhesion process was evaluated by measuring the cytoplasmic spreading area by scanning electron microscopy and evaluating the kinetics of cytoplasmic spreading by interference and reflection microscopy (IRM). In the assays evaluated by scanning microscopy, infected monocytes showed a decrease in cytoplasmic spread over fibronectin with a median area of 41 (34-51) μm2 compared to a group of uninfected cells that had a median area of 72 (55- 89) μm2. Cytoplasmic spreading was inhibited using an anti-VLA-4 antibody capable of blocking the binding of this molecule to the substrate. In the IRM assays, after initial contact with the fibronectin-coated surface, uninfected monocytes spread the cytoplasm rapidly at the rate of 15 μm2 s-1, whereas monocytes infected with L. amazonensis maintained small contacts in the ratio of 5.5 μm2 s-1. After evaluation of the initial and late stages of the adhesion process, the analysis of the expression of the high affinity epitope of the VLA-4 molecule from uninfected and infected monocytes was performed by flow cytometry. Infected cells suffered a decrease in VLA-4 expression from 39 ± 21% to 14 ± 3%; and LFA-1 from de 37 ± 32% to 18 ± 16%. Our data demonstrate that L. amazonensis infection does not alter the initial phases (rolling phase) of the adhesion process, but it affects the late phases (firm adhesion) since it maintains the integrin molecules in states of low affinity and prevents the cytoplasmic spread of infected monocytes. Thus, the observed effects on the function of integrins may play a relevant role in the retention or migration of leukocytes from the site of infection to the draining lymph node as well as in the immune synapses during the presentation of antigens. However, more studies are needed to prove these hypotheses.
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