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ASSOCIAÇÃO GENÉTICA E FUNCIONAL DE MICRORNAS NA HANSENÍASEPAULA FERNANDES TAVARES CEZAR DE MELLO
Mello, Paula Fernandes Tavares Cezar de | Fecha del documento:
2015
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Resumen en portugues
A hanseníase é uma doença infecciosa e crônica que tem o Mycobacterium leprae como agente etiológico. A doença se apresenta através de um espectro clínico onde as variações genéticas do hospedeiro contribuem para os fenótipos de resistência ou susceptibilidade à doença, associados ao balanço da resposta imune entre os polos Th1 x Th2, respectivamente. O objetivo deste estudo foi investigar o papel de miRNAs na imunopatogênese da hanseníase. Os MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que atuam no silenciamento da expressão gênica. Para isso, foram utilizadas abordagens genéticas e funcionais. Através de um estudo do tipo caso-controle, investigamos a associação de seis polimorfismos de base única (SNP) em genes de miRNAs. Dentre eles, dois estão ausentes na população estudada, o miR-125a (rs12975333 G>T) e miR- 223 (rs34952329 *>T). O miR-196a-2 (rs11614913 C>T) não foi associado à hanseníase. Em contrapartida, dos três SNPs do miR-146a estudados (rs2431099, rs2431697 e rs2910164), apenas a variante rs2910164 (G>C) foi associada à susceptibilidade a hanseníase per se (GC OR=1,44, p=0,04; CC OR=2,18, p=0,0091), dado corroborado através de um estudo de famílias (p= 0,003). Além disso, o miR-146a apresenta níveis elevados em biópsias de nervo (p= 0,01), e a estratificação por genótipo revelou que portadores do alelo-C (alelo de risco) apresentaram maior expressão do miR-146a (p=0,04). In vitro, sua expressão foi induzida pela exposição de macrófagos ao bacilo viável (p<0,05). Sabe-se que o miR-146a suprime a produção de TNF-\03B1. Assim, mostramos que indivíduos carreadores do alelo-C, tanto em nervos (p= 0,0453) quanto em PBMC estimulados com BCG (p= 0,0352), apresentam baixos níveis de TNF-\03B1
Em conjunto, fica clara a correlação entre o genótipo de susceptibilidade e modulação dos níveis de TNF-\03B1. Na segunda parte deste trabalho, foi realizado um estudo com macrófagos derivados de medula óssea-(BMDM) provenientes de camundongos selvagens ou nocautes para o miR-146a. A infecção dos BMDM selvagens com a bactéria viável resultou em aumento da expressão do miR-146a (p< 0,05), corroborando o que foi previamente observado. BMDM nocautes infectados com M. leprae apresentaram uma maior expressão de TNF-\03B1 comparado às células selvagens. Ainda, observou-se uma queda de 66,5% na viabilidade intracelular do M. leprae nestas células. Contudo, não foi possível correlacionar este achado com mecanismos de killing, tais como a produção de NO e a ativação da via autofágica. O diagnóstico precoce de indivíduos com a doença latente é ainda um dos grandes desafios no controle da hanseníase. Assim, analisou-se os níveis de miRNAs do sangue periférico como potenciais biomarcadores, usando-se um painel de 93 miRNAs candidatos. A comparação entre pacientes paucibacilares-(PB) e multibacilares-(MB) mostrou que o miR-15b estava induzido e o miR-30e-5p estava reprimido em pacientes MB. Ao passo que a comparação entre contatos e pacientes-MB identificou, além dos miRNAs citados anteriormente, que o miR-196a estava reprimido em MB. Por fim, o miR-484 estava induzido em pacientes quando comparados a contatos e o miR-206 estava reprimido em pacientes quando comparados aos indivíduos saudáveis. A ontologia gênica dos RNAm-alvos dos miRNAs diferencialmente expressos indicou o envolvimento das vias de ubiquitinação/autofagia
Resumen en ingles
Leprosy is an infectious and chronic disease caused by Mycobacterium leprae. The disease presents itself through a clinical spectrum where the host\2019s genetic variations contribute to the resistance or susceptibility phenotypes, associated with the balance of the immune response between the Th1 x Th2 poles, respectively. The aim of this study was to investigate the role of miRNAs in the immunopathogenesis of leprosy. MicroRNAs are small non-coding RNAs that silence the gene expression. For this, genetic and functional approaches were used. Through a case-control study, we investigated the association of six single nucleotide polymorphisms (SNPs) in miRNA genes. Among them, two are absent in the population studied, miR-125a (rs12975333 G>T) and miR-223 (rs34952329 *>T). MiR-196a-2 (rs11614913 C>T) was not associated with leprosy. In contrast, out of the three miR-146a SNPs studied (rs2431099, rs2431697 and rs2910164), only the variant rs2910164 (G> C) was associated with leprosy susceptibility per se (GC OR = 1.44, p = 0.04; CC OR = 2.18, p = 0.0091), corroborated by a family-based study (p = 0.003). In addition, nerve biopsies had high levels of miR-146a (p=0.01), and genotype stratification revealed that subjects carrying the C-allele (risk allele) had higher miR-146a expression (p= 0.04). In vitro, its expression was induced by the exposure of macrophages to the viable bacillus (p <0.05). MiR-146a is known to suppress TNF-\03B1 production. Thus, we showed that individuals carrying the C-allele, both in nerves (p = 0.0453) and in BCG-stimulated PBMC (p = 0.0352), present low levels of TNF-\03B1. Together, the correlation between the susceptibility genotype and the modulation of TNF-\03B1 level is evident
In the second part of this work, we conducted an investigation using bone marrow derived macrophages (BMDM) from mice lacking the miR-146a gene and wild-type. Infection of wild-type BMDM with viable bacteria resulted in increased expression of miR-146a (p <0.05), corroborating what was previously observed. BMDM knockouts infected with M. leprae had a higher expression of TNF-\03B1 compared to wild-type cells. Furthermore, a decrease of 66.5% in the intracellular viability of M. leprae was observed in these cells. However, it was not possible to correlate this finding with killing mechanisms, such as NO production and autophagy activation. Early diagnosis of individuals with latent disease is still one of the major challenges in controlling leprosy. Thus, miRNAs levels from peripheral blood were analyzed as potential biomarkers, using a panel of 93 candidate miRNAs. The comparison between paucibacillary-(PB) and multibacillary-(MB) patients showed that miR-15b was induced and miR-30e-5p was repressed in MB patients. Whereas, in addition to the miRNAs mentioned above, the comparison between contacts and MB-patients identified that miR-196a was repressed in MB. Finally, miR-484 was upregulated in patients when compared to contacts and miR-206 was downregulated in patients when compared to healthy subjects. The gene ontology analysis of predicted mRNA-targets for differentially expressed miRNAs indicated the involvement of ubiquitination/autophagy pathways
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