Desenvolvimento e padronização de uma reação de PCR multiplex para a genotipagem de protozoários patogênicos

Abstract

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs), como a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo. Apesar do impacto causado por estas doenças, as mesmas continuam sendo pouco estudadas. O reino Protista, ao qual os agentes etiológicos dessas doenças pertencem, incluem espécies de importância veterinária que causam muitas perdas para a indústria pecuária. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas para o estudo de protozoários parasitos. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como loci para genotipagem desses protozoários, de modo a obter uma melhor caracterização interespecífica. Neste estudo, foram utilizadas técnicas de PCR singleplex e multiplex para a genotipagem de 16 espécies de protozoários de três diferentes gêneros: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (classe Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (filo Apicomplexa). Como metodologia de biologia molecular foram utilizados PCR e sequenciamento, bem como em bioinformática, onde foi utilizado filogenia molecular. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares de iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Além disso, os seguintes parasitos de importância para a saúde pública: T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. Vivax, foram utilizados neste trabalho A partir dos 39 pares de iniciadores, 9 pares foram selecionados compreendendo 7 loci para o presente estudo: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seril-tRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Os testes a partir de diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma spp., Leishmania spp. e Plasmodium spp., onde mostraram uma sensibilidade de até 1 pg/\03BCL de DNA (para o locus Leucyl-tRNA synthetase em Trypanosoma e Leishmania). A reação inicial de PCR singleplex padronizada foi eficiente para todos os loci, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, a qual foi utilizada um conjunto de iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multilocus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania spp. e Trypanosoma spp. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem-sucedida, e pode-se destacar após a observação de conjunto de resultados que o melhor locus em termos de especificidade, sensibilidade e fidelidade aos dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises