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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14353
IMPLEMENTAÇÃO DA TECNOLOGIA DE IGY PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
Santos, Fernanda Nunes | Data do documento:
2012
Título alternativo
Implementation of IgY technology for the diagnosis of canine visceral leishmaniasisAutor(es)
Orientador
Coorientador
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e
aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por
métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a
identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este
estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA
para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY antiIgG
canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e
a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e
purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno
imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O
ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus
parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de
mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi
constante, sem diferença significativa nos meses analisados (p>0,05), com média de
97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma
forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada
ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento
significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (p<0,05)
onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado
(p>0,05). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG
canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de
reconhecer IgG de outras espécies animais. A conjugação da IgY a enzima peroxidase
ocorreu sem danos à sua estrutura, com discriminação entre as amostras positivas e
negativas em todas as diluições do conjugado e concentrações do antígeno testadas. O
ELISA utilizando IgY conjugada a peroxidase apresentou 100% de sensibilidade e 100
% de especificidade. A comparação dos parâmetros de acurácia do ELISA utilizando
IgY com o ELISA utilizando IgG de mamíferos demonstraram valores idênticos. A
repetibilidade do ensaio de ELISA IgY foi superior a encontrada com o ELISA IgG,
com coeficiente de correlação intraclasse (ICC) estatisticamente significante
(p<0,0001). Um maior agrupamento das amostras negativas e positivas, também
verificada quando a correlação das duplicatas nas duas observações foram analisadas
(p<0,0001). Diante de todos esses resultados a IgY ligada à peroxidase demonstrou ser
um conjugado enzimático de excelente qualidade, revelando um melhor desempenho
quando comparado ao conjugado produzido por mamíferos.
Resumo em Inglês
The serological diagnostic methods are still the most realistic and applicable tools for
the identification of dogs with visceral leishmaniasis. The research for more efficient
methods of simple execution for the identification of the canine reservoir is extremely
important for disease control. The aim of this study was the development and
performance evaluation of an ELISA assay for canine visceral leishmaniasis, using as
enzyme conjugate an IgY anti-dog IgG. To this end, laying hens were immunized with
purified dog IgG, and the IgY anti-IgG was isolated from the egg yolks by precipitation
with polyethylene glycol and purified through thiophilic adsorption. The specificity
against the immunizing antigen was assessed by double radial immunodifusion, ELISA
and western-blot. The ELISA was developed using IgY conjugated to horseradish
peroxidase enzyme, and the accuracy parameters were assessed and compared with
ELISA using mammalian IgG conjugated to horseradish peroxidase. The total
concentration of IgY isolated from the yolks was constant, no significant difference was
detected over the months of duration of the study (p>0.05) and the mean was 97.55 mg
IgY/ yolk. The IgY produced recognized dog IgG, showing a strong sensitivity and
specificity in ELISA, but it was not detected in the double radial immunodifusion. After
immunization, the production of specific IgY increased significantly from the first to the
second month (p<0.05) and then a stable peak with no production decrease was
observed until the end of the analyzed period (p>0.05). In the western-blot, IgY showed
high reactivity against purified dog IgG and that present in the serum of clinically
healthy dogs, and it was not able to recognize the IgG from other animal species. IgY
was conjugated to horseradish peroxidase enzyme without any damage to its structure,
distinguishing between positive and negative samples in all conjugate dilutions and
antigen concentrations tested. The ELISA using IgY conjugated to horseradish
peroxidase showed 100% sensitivity and 100 % specificity. The comparison of the
accuracy parameters of ELISA using IgY and ELISA using mammalian IgG showed
identical values. The repeatability of ELISA IgY was higher than that found with the
ELISA IgG, with interclass correlation coefficient (ICC) was statistically significant
(p<0,0001), a larger grouping of positive and negative samples that was also verified
when the correlation of duplicates of both observations was analyzed (p<0.0001). Thus,
IgY linked to horseradish peroxidase proved to be an excellent conjugate that showed
better performance than the conjugate produced by mammals.
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