Use este identificador para citar ou linkar para este item:
AVALIAÇÃO DE INFECÇÃO NATURAL DE FLEBOTOMÍNEOS (DÍPTERA: PSYCHODIDAE) POR LEISHMANIA SPP. EMPREGANDO ENSAIOS DE PCR MULTIPLEX E PCR EM TEMPO REAL
Leishmania
Patologia Molecular
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Resumo
No presente estudo, a metodologia de PCR multiplex seguida de hibridização não radioativa direcionada para a região conservada dos minicículos do kDNA (gênero Leishmania) e para o gene constitutivo cacophony de flebotomíneo (gênero Lutzomyia) foi inicialmente empregada para a avaliação da taxa de infecção natural em flebotomíneos provenientes de diferentes áreas endêmicas de LT e LV do Brasil, as quais apresentam diferentes graus de endemicidade e transmissão para uma ou outra forma da doença. Para a determinação do índice de infecção natural, considerou-se o mínimo de 1 (um) inseto infectado em cada pool positivo. Em Saquarema, foram constituídos polls de Lu. Intermédia (13\2642 / 30\2640) e Lu. Migonei (0\2642 / 3\2640), sendo que nehum grupo de fêmea foi positivo para infecção por Leishmania spp. O mesmo ocorreu em Além Paraíba e Rio Bonito, onde foram coletados exemplares apenas de Lu. Intermédia, totalizando a formação de pools consistindo de 11\2642 / 30\2640 e 8\2642 / 27\2640, respectivamente. No município do Rio de Janeiro foram constituídos polls de Lu. intermedia (27\2642 / 32\2640 ), onde 5/32 (15,6%) grupos de fêmeas forampositivos (dois da localidade Pau da Fome e três de Colônia Juliano Moreira), e Lu. Migonei (8\2642 / 5\2640) com 3/5 (60%) polls de fêmeas positivos (um de Colônia Jmoreira e 2 de Pau da Fome). Os ensaios de hibridização confirmaminfecção por L. (V.) braziliensis nos 8/37 pools positivos, indicando un índice mínimo de infecção natural de cerca de 2% nos flebótomos avaliados.
Em Porto Alegre também foram obtidos resultados positivos para infecção por L. (V.) braziliensis em 3/98 (3,1%) grupos de fêmeas de Lu. Neivai e 2/52 correspondentes à Lu. Fischerii (3,8%), representando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 0,3% para as duas espécies de flebótomos. Não foram obtidos resultados positivos para os pools de fêmeas de Lu. Migonei (n=28) e Lu. Lanei (n=2) coletados na região. Os resultados de Porto Alegre permitiram confirmar estudos prévios que sugeriram Lu. Neivai como principal vetor de LTA no municipio. Em Corumbá foram formados polls para as espécies Lu. Cruzi (12\2642 / 13\2640) e Lu. Foratinii (6\2642 / 14\2640). Nesse município identificamos infecção por L. Infantum chagasi em 2/13 (15,4%) amostras de fêmeas de Lu. Cruzi e em 1/14 (7,1%) de Lu. Forattinii, representando um índice total de infecção natural de 1,1% (3/27). Os dados obtidos em Corumbá reafirmaram a importância de Lu. Cruzi como principal espécie vetora de LV no município, além de sugerir o papel de Lu. Forattinii como segunda espécie transmissora da doença nesta região. Visando o estudo da estimativa da carga parasitária nos pools de fêmeas que foram positivos pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização, padronizamos a metodologia de PRC em tempo real, utilizando o sistema de detecção SYBR Green (para os dois alvos separadamente \2013 cacophony e kDNA), o qual nos permitiu detectar, quantificar e também diferenciar os parasitos no nível de subgênero, através da curva de dissociação dos produtos amplificados dos kDNA. Em relação às amostras provenientes de Corumbá, os polls positivosapresentaram uma quantificação de cerca de 100 parasitos/pool (2 de Lu. Cruzi e 1 de Lu. Foratinii).
Além desses, dois novos polls de Lu. Foratinii foram positivos, com cerca de 10 e 1 parasitos cada. Em Porto Alegra, dos 5 pools positivos pela PCR multiplex, 3 foram quantificados com cerca de 100 parasitos (2 Lu. Neivai e 1 Lu fischerii), os outros 2 apresentaram uma média de 10 parasitos (1 lu. Neivai e 1 Lu. Fischeri). As amostras coletadas no Rio de Janeiro apresentaram uma quantidade média de 10 parasitos cada (4 de Lu. Intermedia e 3 de Lu. Migonei), sendo que um polls de Lu. Intermedia positivo pelo diagnóstico qualitativo não pôde ser avaliado quantitativamente. A análise das curvas de dissociação para a determinação dos valores de Tm dos produtos amplificados do kDNA de promastigotas de L. (V.) braziliensis e L. (L.)chagasi, corroboraram os resultados prévios de diagnóstico pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização. Investigações diagnósticasque possibilitem a detecção, correta identificação e quantificação de carga parasitária por Leishmania spp na fauna flebotomínea em áreas com notificações de LTA e/ou LVA em humanos ou reservatórios animais, certamente contribuem para uma maior visão do quadro de veiculação das espécies de parasitos nas distintas áreas, fornecendo dados importantes para a compreensão da eco-epidemiologia dessas doenças nas respectivas áreas
Resumo em Inglês
In this study, t
he multiplex PCR methodology was initially established with the purpose of assessing the
natural infection rate in sand flies from different endemic areas of CL and VL in Brazil, which consist of
various degrees of endemicity and transmission to all the fo
rms of the disease. It is followed by non
-
radioactive hybridization, focused on the conserved area of kDNA minicircle (
Leishmania
) and the
constitutive gene cacophony of sand fly (
Lutzomyia genus
). To determine the rate of natural infection, it
was conside
red a minimum of one (1) infected insect to each positive pool. In Saquarema, pools of
Lu.
intermedia
(13 ♂ / 30 ♀) and
Lu. migonei
(0 ♂ / ♀ 3) were identified and no female groups were positive
for infection with
Leishmania
spp. It also occurred in Além Paraíba and Rio Bonito, where there were only
collected specimens of
Lu. intermedia
, leading to the es
tablishment of pools, comprising of 11 ♂ / 30 ♀
and 8 ♂ / 27 ♀, respectively. In the district of Rio de Janeiro there were pools of
Lu. intermedia
(27 ♂ / 32
♀), in which 5 / 32 (15.6%) females groups were positive (two from Pau da Fome and three from Colo
nia
Juliano Moreira), as well as 3 / 5 (60%) positive females pools of
Lu. migonei
(8 ♂ / ♀ 5) (one of them
from Colonia Juliano Moreira and the other two from Pau da Fome). Hybridization tests have confirmed
the infection by
L. (V.) braziliensis
in 8 / 37
of the positive pools, indicating a minimum rate of natural
infection of approximately 2% of the evaluated sand flies. In Porto Alegre, positive results were also
obtained for infection by
L. (V.) braziliensis
in 3 / 98 (3.1%) females groups of
Lu. neivai
and 2 / 52
corresponding to
Lu. fischerii
(3.8%), representing a minimum rate of natural infection of approximately
0.3% for the two species of sand flies. No positive results were obtained for females pools of
Lu. migonei
(n = 28) and
Lu. lanei
(n = 2) w
hich were collected in the area. The results from Porto Alegre helped to
confirm previous studies suggesting
Lu.neivai
as the district’s main vector of leishmaniasis. In Corumbá,
there were obtained pools for the species
Lu. cruzi
(12 ♂ / 13 ♀) and
Lu. for
atinii
(6 ♂ / 14 ♀). We
identified an infection by
L. infantum chagasi
in 2 / 13 (15.4%) samples from females of
Lu. cruzi
and 1 /
14 (7.1%) females of
Lu. foratinii
, representing a total rate of natural infection of 1.1% (3 / 27). The
obtained data in Cor
umbá reassured the importance of
Lu. cruzi
as the district’s VL main vector species
and also suggested the role of
Lu. forattinii
as the second disease transmitter species in this area.
Aiming at the estimate study of parasite load in positive females poo
ls, according to multiplex PCR
-
hybridization, we standardized the real
-
time PCR methodology, using SYBR Green detection system (for
both targets individually
-
cacophony and kDNA), which allowed us to detect, quantify and differentiate the
level of parasit
es in the subgenus by means of kDNA amplified products dissociation curve.
Regarding Corumbá’s samples, the positive pools showed an amount of approximately 100 worms / pool
(2
Lu. cruzi
and 1
Lu. foratinii
). Furthermore, two new
Lu. foratinii
pools were
positive approximately with
10 and 1 parasite respectively. In Porto Alegre, from a total of 5 positive pools, 3 of them were identified
according to multiplex PCR in approximately 100 parasites (2
Lu. neivai
and 1
Lu.fischerii
) and the other
2 had an av
erage of 10 parasites (1
Lu. neivai
1 and
Lu. fischerii
). The samples collected in Rio de
Janeiro had an average amount of 10 parasites each (4
Lu. Intermedia
and 3
Lu migonei
). One of them,
which was positive according to qualitative diagnosis, could not
be quantitatively evaluated. The analysis
of dissociation curves for determining the Tm values of kDNA amplified products of promastigotes of
L.
(V.) braziliensis and L. (L.) chagasi
corroborated the previous results of diagnostic testing by means of
PCR
multiplex hybridization. Thus, it is important to highlight that diagnostic investigations will certainly
contribute to a greater view of the scope of the establishment of parasite species in different areas,
providing important data for the understanding
of the eco
-
epidemiology of these diseases. This process
allows the detection, proper identification and quantification of parasite burden in
Leishmania
spp sand fly
fauna in areas reporting ACT and / or AVL in humans or animal reservoirs
DeCS
PsychodidaeLeishmania
Patologia Molecular
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex
Compartilhar