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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/12168
OTIMIZAÇÃO DE FERRAMENTAS MOLECULARES BASEADAS EM MULTIPLEX PCR PARA INCLUSÃO DE CONTROLES DE QUALIDADE AMOSTRAL NO DIAGNÓSTICO DAS LEISHMANIOSES
Diagnóstico
Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex
Controle de qualidade
Reação em Cadeia da Polimerase/métodos
Reação em Cadeia da Polimerase/normas
Técnicas de diagnóstico molecular
Controle de qualidade
Albuquerque, Suênia da Cunha Gonçalves de | Date Issued:
2014
Alternative title
Development of molecular tools multiplex PCR-based for the inclusion of sample quality controls in the diagnosis of leishmaniasisAdvisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract in Portuguese
A detecção precoce das leishmanioses e a rápida instituição do tratamento são de suma importância para os indivíduos e comunidades afetadas, visto que pacientes contribuem para a manutenção do ciclo da doença. Diante das limitações apresentadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico, a PCR tem se apresentado como ferramenta promissora para a detecção dos casos. No entanto, perdas de DNA durante o processo de purificação podem afetar mais significativamente o material genético dos parasitos, gerando resultados falso-negativos. Este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar dois protocolos de triplex PCR para investigar possíveis causas de negatividade no diagnóstico molecular das formas visceral (LV) e tegumentar (LT) das leishmanioses. Pares de primers para detecção de um controle interno (gene G3PD) e dois controles externos (DNA genômico de M. pachydermatis e plasmídeo comercial pUC18 foram adaptados a protocolos de PCR convencionais validados para a detecção de L. infantum e L.(V.) braziliensis e duas reações triplex foram otimizadas. Dados de sensibilidade (S), especificidade (E) e eficiência (e) dos novos sistemas foram calculados em 186 amostras de sangue coletadas de cães em áreas endêmicas, utilizando como referência protocolos de PCR e PCR em tempo real (qPCR) consagrados na literatura. A concordância entre os novos testes e os testes de referência foi determinada pelo cálculo do índice de Kappa. A tríplex PCR para o diagnóstico da LV mostrou S = 78.68 por cento, E= 85.29 por cento e e= 81.05 por cento com boa concordância (K = 0.60, p < 0.0001) com o conjunto de resultados PCR/qPCR. Para o diagnóstico da LT observou-se S = 97.29 por cento, E = 79.16 por cento, e = 90.16 por cento, com K = 0.78, (p < 0.0001) indicando excelente nível de concordância entre os testes. As novas ferramentas apresentadas podem ser aplicadas para aumentar a acurácia no diagnóstico das leishmanioses, contribuindo para a rápida implementação do tratamento e, reduzindo a longo prazo os índices de mortalidade e morbidade das leishmanioses.
Abstract
Early detection of leishmaniases and rapid initialisation of treatment are paramount for individuals and communities affected, since infected people contribute to maintain the disease cycle. Due to the limitations presented by traditional diagnostic methods, PCR has emerged as a promising tool for the detection of cases. Loss of DNA during the purification process can affect more significantly the genetic material of the parasites and causing false-negative results. This study aimed to develop and evaluate two triplex PCR protocols to investigate possible causes of negativity in molecular diagnosis of visceral (VL) and cutaneous (CL) of leishmaniases. Pairs of primers for the internal control detection (G3PD gene) and two external controls (genomic DNA of M. pachydermatis and commercial plasmid pUC18 were adapted to conventional PCR protocols validated for the detection of L. infantum and L.(V.) braziliensis and two triplex reactions were optimized. The sensitivity (S), specificity (Sp) and efficiency (e) of the new systems were calculated in 186 blood samples collected from dogs in endemic areas, using as reference PCR and real-time PCR (qPCR) protocols established in the literature. The level of agreement between the new test and the reference tests was determined by calculating the Kappa index. The triplex PCR for the diagnosis of VL showed S = 78.68%, Sp = 85.29% and e = 81.05% e with good agreement (K = 0.60, p <0.0001) with the results of PCR/qPCR. For the diagnosis of CL, S = 97.29%, Sp = 79.16% and e = 90.16% were observed with K = 0.78, (p <0.0001) indicating excellent level of agreement between the tests. The new tools presented herein can be applied to increase the accuracy in the diagnosis of leishmaniases, contributing to the rapid implementation of treatment and reducing the mortality and morbidity of leishmaniases.
Keywords in Portuguese
LeishmanioseDiagnóstico
Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex
Controle de qualidade
DeCS
Leishmaniose/diagnósticoReação em Cadeia da Polimerase/métodos
Reação em Cadeia da Polimerase/normas
Técnicas de diagnóstico molecular
Controle de qualidade
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